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达量分别为0.2580±0.0195、0.8113±0.0107、0.3707±0.0194、0.4540±0.0132，均明显低于空白对照组及阴性对照组(分别为0.9413±0.0103、0.9343±0.0185， P<0.01)；Western Blot结果显示， pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR–EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-2、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4转染组细胞中EP-CAM蛋白的相对表达量分别为0.1998±0.0214、0.6920±0.0225、0.3157±0.0175、0.4079±0.0239，亦均明显低如空白对照组及阴性对照组（分别为0.7969±0.0160、0.8093±0.0137， P<0.01）；其中pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1质粒的干扰效果最佳，对mRNA和蛋白表达的抑制率分别为(72.6±2.0)％和(74.9±2.1)％。3、用干扰效果最佳的pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1转染GBC-SD细胞后：①显微镜下观察，干扰组、空白对照组及阴性对照组细胞的形态无明显差异；②MTT法显示，与空白对照组及阴性对照组相比干扰组细胞的增殖活性受到明显抑制（P<0.05）；③流式细胞仪检测显示，空白对照组、阴性对照组及干扰组细胞的凋亡率分别为（9.56±0.77）%、（10.57±0.76）%、（10.03±0.57）%，三者之间的差异无统计学意义（p>0.05）。④Transwell侵袭实验结果表明，干扰组的穿膜细胞数为（57±7）明显少于空白对照组及阴性对照组（分别为107±9,102±12;P<0.01）。 结论：1、靶向EP-CAM基因的特异性miRNA能有效地降解EP-CAM基因mRNA、抑制EP-CAM蛋白的表达。2、RNAi技术沉默人胆囊癌GBC-SD细胞中EP-CAM基因表达，能有效地抑制GBC-SD细胞的增殖活性及侵袭力。3、EP-CAM基因可能成为胆囊癌基因治疗的潜在靶点。 目的:利用RNA干扰技术沉默胆囊癌GBC-SD细胞中上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EP-CAM）基因的表达，探讨沉默EP-CAM基因表达对GBC-SD细胞形态、增殖、凋亡及侵袭力的影响，为胆囊癌的基因治疗提供一定的理论基础和试验依据。 方法：1、根据Genebank accession number：BC014785提供的基因序列，利用invitrogen公司的在线RNAi设计工具,设计针对EP-CAM基因不同位点的4个特异性miRNA干扰序列；将选择的序列和相应的基因组数据库进行BLAST序列比对，确信所选择的序列与其他的基因不具有同源性；以鼠miR-155为骨架构建4个针对EP-CAM基因的特异性miR RNAi表达质粒，并进行DNA测序验证。2、用Lipofect-amine?2000介导分别将pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1、-2、-3、-4转染人胆囊癌GBC-SD细胞株，试验另设阴性对照组（转染pcDNA?6.2-GW/-EmGFPmiR-neg）及空白对照组（未转染组），瞬转48h后分别用RT-PCR和Western Blot检测各组GBC-SD细胞中EP-CAM的mRNA及蛋白的表达情况，筛选出干扰效率最强的一个miR RNAi表达质粒。3、用干扰效率最强的pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR–EPCAM-1转染GBC-SD细胞作为干扰组，观察GBC-SD细胞的生物学行为变化：①显微镜观察转染前后细胞形态学的变化；②MTT法检测细胞增殖的变化；③Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡的变化；④Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力的变化。 结果：1、DNA测序分析证实，表达质粒pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-2、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4中的插入片段序列均与设计的miRNA oligo序列一致，4个针对EP-CAM基因的miR RNAi表达载体均构建成功。2、转染48h后， RT-PCR结果显示， pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-2、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4转染组中EP-CAM mRNA的相对表达量分别为0.2580±0.0195、0.8113±0.0107、0.3707±0.0194、0.4540±0.0132，均明显低于空白对照组及阴性对照组(分别为0.9413±0.0103、0.9343±0.0185， P<0.01)；Western Blot结果显示， pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR–EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-2、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4转染组细胞中EP-CAM蛋白的相对表达量分别为0.1998±0.0214、0.6920±0.0225、0.3157±0.0175、0.4079±0.0239，亦均明显低如空白对照组及阴性对照组（分别为0.7969±0.0160、0.8093±0.0137， P<0.01）；其中pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1质粒的干扰效果最佳，对mRNA和蛋白表达的抑制率分别为(72.6±2.0)％和(74.9±2.1)％。3、用干扰效果最佳的pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1转染GBC-SD细胞后：①显微镜下观察，干扰组、空白对照组及阴性对照组细胞的形态无明显差异；②MTT法显示，与空白对照组及阴性对照组相比干扰组细胞的增殖活性受到明显抑制（P<0.05）；③流式细胞仪检测显示，空白对照组、阴性对照组及干扰组细胞的凋亡率分别为（9.56±0.77）%、（10.57±0.76）%、（10.03±0.57）%，三者之间的差异无统计学意义（p>0.05）。④Transwell侵袭实验结果表明，干扰组的穿膜细胞数为（57±7）明显少于空白对照组及阴性对照组（分别为107±9,102±12;P<0.01）。 结论：1、靶向EP-CAM基因的特异性miRNA能有效地降解EP-CAM基因mRNA、抑制EP-CAM蛋白的表达。2、RNAi技术沉默人胆囊癌GBC-SD细胞中EP-CAM基因表达，能有效地抑制GBC-SD细胞的增殖活性及侵袭力。3、EP-CAM基因可能成为胆囊癌基因治疗的潜在靶点。