三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)光合效率高,繁殖周期短,脂肪酸含量较高,使其具有生产生物柴油的潜力。三角褐指藻目前已完成全基因组测序,高效的基因枪、电穿孔转化体系也已成功构建,可实现RNA介导的基因沉默,使其成为一个更具吸引力的探索基因功能的模型系统。β-1,3葡聚糖(金藻昆布多糖)是三角褐指藻的主要储存多糖,其合成底物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG),由尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase)催化可逆反应UTP+G-1-P ←→ UDPG+PPi生成。马铃薯(Solanum tuberosum L)、甘蔗(Saccharum officinarum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等高等植物UGPase的研究表明,UGPase是碳水化合物代谢途径中的关键酶,并在碳流的分配过程中起着至关重要的作用。为了阐明三角褐指藻UGPase的功能及其对碳流分配的影响,本实验主要包括两部分内容：第一部分,根据已有文献报道,选取不同的磷浓度和温度对三角褐指藻进行处理,实验分别设定5个磷梯度和4个温度梯度,将三角褐指藻培养至指数生长末期；然后采用实时定量PCR (QRT-PCR)技术分析UGPase基因(UGP)的转录水平,测定UGPase的酶活和金藻昆布多糖的含量。初步确定三角褐指藻UGP受磷浓度和温度调控的表达模式。第二部分,首先依据三角褐指藻的全基因组测序结果,对UGP进行初步的信息学分析。根据UGP的信息学分析结果,以遗传转化载体pha-T1为骨架,构建反向重复干扰载体(pUGP-IR)阳反义干扰载体(pUGP-AS516, pUGP-AS237).将这些干扰结构用基因枪分别转入三角褐指藻的基因组。然后我们先用博来霉素(Zeocin)初步筛选出阳性克隆,再用PCR技术检测抗性基因ble。在此基础上,我们进一步采用LA PCR技术对干扰载体的整合位点进行定位。最后我们对转基因藻株进行进一步的研究,分别测定它们的生长曲线和比生长速率,通过QRT-PCR对UGP的转录水平进行分析,测定UGPase的酶活,金藻昆布多糖的含量,总脂的合成量等指标。初步确定三角褐指藻UGPase的功能及其在碳流分配中的作用。第一部分实验的研究结果表明：随着磷浓度的升高,三角褐指藻内UGP的转录水平上调,UGPase的活性升高,同时检测到金藻昆布多糖的含量增加。无磷组的藻株,金藻昆布多糖的含量仅占细胞干重的5%,比对照组降低了57%,对应的UGP的转录水平下调了51%,UGPase酶活也降低了3倍；随着温度的逐渐降低,藻细胞内UGP转录水平上调,UGPase的活性降低,金藻昆布多糖的合成量减少。10℃组藻细胞金藻昆布多糖的合成量最高(16.7%),比对照组(12%)增加了35%,对应的对应的UGP的转录水平上调了21%,UGPase酶活也增加了35%。本研究表明磷对三角褐指藻UGPase起着正调控作用,温度对三角褐指藻UGPase起着负调控作用。此外我们推测UGPase可能是金藻昆布多糖合成途径的关键酶。第二部分实验结果发现：当转基因藻株的UGP转录丰度较野生型三角褐指藻下调4.89倍时,伴随着UGPase的活性下降69%,对应的金藻昆布多糖含量也降低了54.79%,仅占细胞干重的5%,总脂的合成量却增加了15%。本研究通过RNA干扰技术手段使三角褐指藻UGPase失活,导致金藻昆布多糖的含量显著降低,使得更多的总脂积累。这些结果表明,三角褐指藻的UGPase是金藻昆布多糖合成途径的限速酶,在金藻昆布多糖和脂质的生物合成过程中起着重要的碳流分配作用。硅藻的UGP可以作为提高藻细胞脂肪酸含量的候选基因。