中国莱姆病螺旋体MLVA分型方法的建立与研究

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目的:建立适合中国莱姆病螺旋体(又称伯氏疏螺旋体)的多位点可变数目串联重复序列分析(multi-locus variable number tandem repeat analysis, MLVA)基因分型方法,对来自中国12个省45个地区的95株伯氏疏螺旋体进行MLVA分型鉴定和聚类分析,探讨中国伯氏疏螺旋体菌群特征,并为莱姆病的分子流行病学调查,疫情溯源及菌群进化分析提供实验基础和理论依据。方法:1. MLVA是一种以可变数目串联重复序列(variable number tandem repeat, VNTR)为基本单位的,根据每个位点VNTR在不同菌株中的多态性即拷贝数的差异,形成VNTR分辨率,通过VNTR分辨率的可叠加性以获得对菌株的最佳分辨效果的基因分型方法。2.使用Tandem Repeats Finder基因扫描软件扫描中国优势菌种Borrelia garinii的国际参考菌株PBi的904.246kb染色体基因和质粒(CP26和LP54)基因,分析基因结构特点,筛选多个潜在的VNTR位点。3.利用PCR(Polymerase Chain Reaction)技术检验潜在VNTR位点的普遍扩增性和特异性差异的分辨能力。4.通过STR(Short Tandem Repeat)测序收集VNTR信息并建立菌株VNTR谱。5.聚类分析,用BioNumerics5.1软件处理数据,用Categorical系数和UPGMA(Unweighted Pair-Group Method withArithmetic,非加权算术平均法)进行聚类分析,初步建立莱姆病螺旋体的MLVA分型方法,进而对95株中国菌株和6株国际参考株进行MLVA分型研究,并与多位点序列分析(multi-locus sequenceanalysis, MLSA)的基因分型结果进行比较。结果:1.筛选出5个VNTR位点进行组合,建立莱姆病螺旋体的MLVA方法。将101株莱姆病螺旋体分为51个独立的基因型,4个明显的基因簇,即Borreliaburgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia valaisiana。分型结果与MLSA基因分型结果一致。2.全部5个VNTR位点(VNTR-1, VNTR-2, VNTR-3, VNTR-4,和VNTR-5)对应的等位基因种类数分别为7,3,9,7和6;相应的位点多态性指数为0.79,0.22,0.77,0.71和0.67;5个VNTR位点分辨率叠加,多态性指数达0.96。结论:1.建立了一种适合中国莱姆病螺旋体菌株的ML VA基因分型的方法。MLVA分型方法操作简单,分型稳定,重复性好,分型结果准确可靠。2.聚类分型结果表明中国莱姆病螺旋体表现出广泛的遗传异质性,存在Borreliaburgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia valaisiana四个基因型,并且在南北方分布存在明显差异。
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