论文部分内容阅读
植物抗病基因的研究一直以来是植物分子生物学研究领域的热点之一，迄今已经从不同的宿主中分离了50多个抗病基因，其中仅有6个是隐性基因，这些隐性抗病基因的作用机理目前尚不能用广为接受的显性基因的作用机理来进行解释。水稻中已经鉴定32个主效抗白叶枯病基因，其中9个为隐性抗病基因。位于第8染色体长臂末端的xa13基因就是其中的一个典型，它完全隐性抗性、特异性的抗白叶枯病菌菲律宾菌系生理小种6（PXO99）、和其它显性或隐性抗白叶枯病基因存在抗性互作，说明xa13基因抗病机理的特异性。 为克隆xa13基因，采用基因组饱和杂交的原理，在9个发育时期取材构建了水稻品种明恢63全生育期均一化cDNA文库。以分子标记E6a和另一端标记S14003为起始，构建了xa13基因区段的物理图谱，并结合3个F2群体和Shotgun测序结果将该基因定位于一个9.2kb的DNA片段上。同时通过精细物理定位xa13基因，开发了数个与该基因紧密连锁的基于PCR技术的分子标记，为采用分子标记辅助选择xa13育种提供了经济、方便的分子标记。 在优化了一套适合于水稻品种IRBB13的转基因组培体系的基础上，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将携带显性候选基因的片段转入到携带隐性抗病基因的水稻品种IRBB13中，在45株转基因植株后代中，有全长基因导入的30株的表型变为感病，并且4个单拷贝转基因的T1代家系也符合共分离检测，从而验证了候选基因是xa13基因的显性基因Xa13，标志用图位克隆法成功克隆了隐性基因xa13和显性基因Xa13。同时，通过RNA干扰（RNAi）技术，分别抑制水稻品种明恢63和中花11中显性基因Xa13的表达，以及水稻品系IRBB13中隐性基因的表达。通过接种白叶枯病菌PXO99和定量RT-PCR分析发现，明恢63和中花11中Xa13基因表达受到抑制的植株表型由感病变为抗病，IRBB13中xa13基因表达受到抑制的植株抗性进一步加强。 有趣的是，显性基因Xa13和隐性基因xa13在花药中的表达量高于在叶片中的表达量。RNAi转基因植株中Xa13或xa13的表达受到抑制会导致植株不育或半不育，组织学观察发现这些不育单株的多数花粉的发育停留在单核花粉期或二核花粉期。原位杂交的实验证明，Xa13基因在花药中表达的时期与异常花粉发生的时期非常一致，Xa13在花粉发育的早期不表达，在单核花粉期开始高水平表达。从而说明Xa13基因在花粉的发育中也起着重要的作用。 进一步通过大量实验表明，显性基因Xa13是一个受病原调控表达的基因，由显性基因Xa13突变成隐性基因xa13的关键不是编码区内的变化，而是在启动子区的一个约18bp的区间内的突变使基因表达受病原调控的能力丧失，且这种突变不影响其在花粉中的表达。XA13蛋白是一个未知具体生化功能的细胞膜蛋白，属于MtN3家族的成员之一。但其在白叶枯病菌PXO99侵染以及在花粉的发育中发挥着重要的功能，且可能介导新的抗病途径。因此，本研究通过克隆隐性基因xa13以及它的显性基因Xa13，不