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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种脑神经元进行性变性的痴呆性疾病。AD的神经病理标志是脑内分布有大量的β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积形成老年斑(senile plaque, SP),神经元内过度磷酸化tau蛋白聚集形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle),神经元的营养障碍(Neuronal dystrophy)以及神经元大量缺失,突触的损害和丢失。但其具体的机制还不是很清楚,目前对于AD的发生机制提出了多种假设,主要包括p淀粉样蛋白级联假说、tau蛋白过度磷酸化假说、胆碱能假说、基因假说、金属离子假说和突触功能障碍假说等。十几年前Selkoe和Hardy及Higgins等提出Ap假说,该假说解释了AD的发生原因,并且为治疗该疾病提供了依据。而Aβ神经毒性是各种因素引起AD的共同通路,是AD形成和发展的关键因素。因此,近年来AD的治疗研究,大多围绕Ap的形成、聚集以及清除或Ap的神经毒性机制进行。Ap的毒性作用依赖于它的聚集,因此,抑制Ap的聚集成为治疗AD的有效的手段,目前用于抑制Aβ聚集的物质有多种,大量的报道证实热休克蛋白可以抑制Aβ聚集。ATP合酶(ATP synthase)α亚单位被认为是一种热休克蛋白,并与Aβ相互作用,因此,也成为研究的热点。ATP合酶又称为F0F1-ATPase,是一个酶复合物,负责ADP的氧化磷酸化驱动的ATP合成,该酶是通常定位于线粒体内膜,除了在线粒体外还在细胞的其他部位分布,如细胞浆膜上。细胞浆膜上ATP合酶可作为受体介导血管形成、肿瘤存活的调节和细胞内pH调节。值得注意的是,近期的证据显示FOF1-ATP合酶α亚单位可能在神经退行性疾病中发挥重要的作用,例如:在AD病人前脑皮质F0F1-ATP合酶表达增加;ATP合酶在PD病人标本中含量增加两倍;ATP合酶α亚单位能与Aβ和APP结合,也与神经纤维退行性相关。ATP合酶α亚单位可归为热休克蛋白(Heat Shock Protein, HSP)家族,热休克蛋白的主要功能为抑制误折叠的多肽和抑制蛋白质聚集。已发现HSP 70、90,以及小热休克蛋白如HSP22、27均可抑制Ap的聚集和Ap引起的细胞毒性作用。ATP合酶的α亚单位与HSP60的DNA序列具有一定的同源性,尤其在具有分子伴侣功能的两个保守的元件中具有极高的同源性。我们实验室研究发现ATP合酶α亚单位可以降低突变型亨廷顿蛋白(Mutant huntingtin, mhtt)的聚集,减小mhtt对神经细胞的毒性作用。鉴于FoF1-ATP合酶a亚单位有HSP样的功能,及其在AD脑内的异常表达。我们推测ATP合酶a亚单位可能参与抑制Aβ诱导损伤的机制。因此,本课题研究ATP合酶α亚单位是否抑制Aβ诱导的神经毒性损伤,并探讨其机制,主要研究内容如下:1.构建的构建、鉴定和定位构建含有成熟型的ATP合酶a亚单位cDNA的表达载体(pDsRed-N1-ATP syn),PCR和酶切鉴定及DNA测序结果显示载体构建成功,插入序列为ATP syn(M)的DNA片段。Western Blot结果显示有重组蛋白(ATP syn)的阳性条带出现。免疫荧光组化结果显示细胞内有红色荧光蛋白表达。免疫荧光标记结果显示,ATP合酶α亚单位与APP或TOM或者TIM在线粒体内共定位。2.ATP合酶α亚单位过表达对Ap介导的细胞损伤和线粒体膜电位降低的调节纤维状Ap处理情况下可快速上调ATP合酶α亚单位表达。在SY-SH5Y细胞转染pDsRed-N1-ATP syn,纤维状Aβ处理情况下,MTT检测细胞的活力,结果显示与转染空载体DsRed的对照相比,ATP合酶α亚单位过表达情况下,OD值显著增加,提示,ATP合酶α亚单位过表达可抑制Aβ诱导的细胞损伤。同时,WST检测结果显示,表达DsRed-ATP syn融合蛋白的细胞株具有较高的活力。进一步提示,ATP合酶α亚单位过表达可抑制Aβ介导的神经毒性。罗丹明123荧光染色检测线粒体膜电位,结果显示,过表达ATP syn的细胞株的线粒体膜电位明显高于表达空质粒的细胞,提示ATP合酶α亚单位可抑制Aβ引起的细胞毒性介导的线粒体损害。3.ATP合酶α亚单位过表达下调Ap介导的Bax/ Bcl-2比值和活化型caspase-3的增加,可上调Ap诱导的HSP70和ATP合酶p亚单位的表达。稳定表达ATP syn的细胞株给予Ap处理24h,Western blot的结果显示,与转染空载体pDsRed-N 1的细胞组相比,转染了pDsRed-N 1-ATP syn DNA的细胞在Aβ处理后,其Bax/Bcl-2比值和活化型caspase-3均明显小于对照组,提示ATP合酶α亚单位可抑制Ap诱导的凋亡相关蛋白表达及caspase-3激活。另外,ATP合酶α亚单位过表达可调节Ap诱导的HSP70和ATP合酶p亚单位的表达。4.ATP合酶α亚单位原核表达载体的构建对载体中的基因进行PCR鉴定和酶切鉴定结果与理论预测值一致,且DNA测序分析结果进一步证实该表达载体pGEX-4T2-ATP-syn构建的成功。IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳结果显示,在79kD处新增一条富聚的条带,与预测的GST-ATP syn融合蛋白大小一致。在优化诱导表达和分离条件的基础上,大量表达并用GST亲和纯化,用凝血酶酶切切去GST,在经过GST亲和纯化获得ATP synα。5.ATP可协同ATP合酶α亚单位抑制Aβ的聚集,但不能解聚纤维状Aβ,ATP也不能促进ATP合酶α亚单位解聚纤维状Aβ这种情况。原核表达的ATP合酶α亚单位与Aβ共孵育不同时间,ThT法检测Ap的荧光强度,结果显示,Aβ和ATP合酶α亚单位组荧光强度明显降低,提示,ATP合酶α亚单位抑制Aβ的聚集,且在ATP存在的情况下,ATP合酶a亚单位抑制Aβ聚集的作用更明显,提示ATP可协同ATP合酶α亚单位抑制Aβ的聚集。此外,浊度法结果同样提示,ATP合酶α亚单位抑制Ap的聚集。解聚实验结果提示,ATP合酶α亚单位不能解聚纤维状的Aβ,ATP不能促进ATP合酶α亚单位的这种解聚作用。6.在AD转基因动物脑内的老年斑内有ATP合酶α亚单位的分布增加,但β亚单位没有增加。总之,ATP合酶α亚单位可以抑制Aβ介导的神经毒性损伤,并且抑制Aβ的聚集,但是对纤维状Ap无解聚作用,同时,ATP能增加ATP合酶α亚单位对Aβ聚集抑制。可能对AD的治疗具有重要的指导意义。