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目的:探讨平颤颗粒含药血清对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶离子(MPP+)诱导大鼠肾上腺嗜铬神经瘤细胞(PC12)凋亡的保护作用及其可能的作用机制,为临床开发防治帕金森病的中药新药提供实验基础。
方法:按照血清药理学的方法制备平颤颗粒含药血清,采用MPP+作用于PC12细胞,建立体外细胞损伤模型。将对数生长期的PC12细胞分为正常对照组、MPP+损伤模型组、平颤颗粒大、中、小剂量组,阳性对照组(美多芭组)及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂组。用MTT法检测各组的细胞活力;Hochest33258染色法观察细胞形态改变;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测Akt及其磷酸化水平。
结果:
1.MTT法显示,平颤颗粒含药血清可抑制500μmol/L MPP+作用24h所诱导的PC12细胞活性的降低,与MPP+组(57.94±2.71%)相比,平颤颗粒大、中、小剂量组的细胞活力分别上升为80.16±3.81%、72.2±3.69%、66.5±5.03%。
2.Hoechst33258染色显示,MPP+处理24h后,多数细胞核固缩,染色质凝聚,呈现不均匀的亮蓝色荧光。平颤颗粒组凋亡细胞明显减少,细胞的荧光强度减弱。
3.流式细胞仪检测显示,MPP+组的细胞凋亡率(43.9%)与正常对照组(2.4%)相比是增加的,大、中、小剂量平颤颗粒预处理后,细胞凋亡率分别降至14.0%,20.2%,31.9%。然而,用PI3K抑制剂LY294002预处理后细胞凋亡率与平颤颗粒大剂量组相比明显升高,增加至35.7%。表明LY294002预处理可使细胞凋亡增多。
4.Western blot检测Akt及其磷酸化水平显示,MPP+可抑制Akt的磷酸化,平颤颗粒各剂量组可显著增加磷酸化Akt的水平。用LY294002预处理后,平颤颗粒提高Akt磷酸化的作用被阻断,磷酸化Akt蛋白表达水平明显下降。说明Akt的激活参与了平颤颗粒对MPP+诱导PC12细胞凋亡信号通路的转导。
结论:平颤颗粒含药血清对MPP+诱导PC12细胞凋亡具有一定的保护作用,其机制可能与PI3K/Akt信号转导通路有关。