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1、目的随着生活水平的提高,生活方式的日益西化,非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的发病率日益升高。NAFLD包括一系列相互联系的病理改变,从单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎,到肝纤维化和肝硬化,甚至可以进展为肝细胞癌。NAFLD已经成为影响我们健康的潜在的重大疾病隐患。并且愈来愈多的资料表明,NAFLD是心脑血管事件和肥胖相关死亡事件的独立相关的疾病。目前认为,NAFLD与肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢综合征密切相关,高脂饮食是引起肥胖及其相关并存症高发的重要原因。而高脂饮食往往合并有血浆游离脂肪酸的升高,游离脂肪酸可以诱导肝细胞的单纯脂肪变性,但其确切的发病机制尚未明确。内质网应激已被证实参与多种疾病的分子机制,包括肥胖和2型糖尿病,后两者都是NAFLD的高危因素。明确内质网应激是否参与了游离脂肪酸诱导的细胞脂肪变性模型的脂变形成过程,并探讨药物比如二甲双胍对内质网应激的潜在影响,对于防治NAFLD具有重要的现实意义。2、方法2.1培养和处理细胞常规10%胎牛血清MEM培养液培养HepG2,当细胞生长到约70-80%融合度时,消化传代,更换培养液进行分组。对照组换用10ml新鲜的10%胎牛血清MEM培养液；二甲双胍组换用10ml新鲜的10%胎牛血清MEM培养液的同时加入0.4ml的50mM二甲双胍的母液(即终浓度为2 mM)；游离脂肪酸组换用10ml含有1mM游离脂肪酸混合物(2：1油酸：棕榈酸)的10%胎牛血清MEM培养液；干预组换用10ml含有1mM游离脂肪酸混合物的10%胎牛血清MEM培养液的同时加入0.4ml的50mM二甲双胍的母液(即终浓度为2 mM)。培养24小时后收获各组细胞,检测细胞活力和脂质含量及后续的PCR和WESTERN BLOT.2.2逆转录PCR分别提取各组HepG2细胞的总RNA,按照反转录盒提供的说明书合成cDNA。设计及合成葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和固醇调节元件结合蛋白1c (SREBP1c)以及脂肪酸合成酶(FAS)的引物,以cDNA作模板,在常规PCR仪上进行PCR扩增。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,用PDQuest半定量分析比较各个PCR产物条带灰度,以目的基因/β-actin mRNA相对值半定量目的基因,分析比较以上表达水平的差异。2.3 Western blot分别裂解细胞后,用BCA法定量蛋白,检测各组葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和固醇调节元件结合蛋白1c (SREBP1c)表达水平,显色、暴光、显影、定影后,吹干,将胶片进行扫描,用凝胶图像处理系统分析目标带的净光密度值,以目的蛋白/GAPDH相对值半定量目的蛋白,分析比较以上表达水平的差异。3、结果游离脂肪酸组诱导的细胞脂肪变性模型的HepG2细胞内的甘油三酯,GRP78的]mnRNA和蛋白表达水平,SREBP1c的mRNA和蛋白表达水平,以及FAS mRNA分别表达水平是298.00±59.63 mmol/mg protein,1.67±0.20,2.21±0.20,0.89±0.22,1.44±0.14,1.00±0.10,与对照组、二甲双胍组比较,均明显升高,有显著性差异(p<0.05)。而干预组的HepG2细胞的甘油三酯、GRP78的mRNA和蛋白表达水平,SREBP1c的mRNA和蛋白表达水平,以及FAS mRNA表达水平分别是270.33±91.82mmol/mg protein,1.50±0.15,1.28±0.34,0.84±0.29,1.18±0.10,0.89±0.19较游离脂肪酸组均有所下降,但是没有显著性差异。然而值得注意的是干预组与游离脂肪酸组的GRP78的mRNA和蛋白质水平比较,尽管没有显著性差异,但是P值接近0.05(P分别为0.053,0.054)。4、结论内质网应激参与了游离脂肪酸诱导的细胞脂肪变性模型的脂变形成过程。内质网应激可能是非酒精性脂肪肝发病机制中新的干预靶点和治疗靶点。