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背景与目的:肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC),是世界范围内发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一,而DNA甲基化与肺癌的关系密切,在肺癌的发生发展中扮演着极其重要的角色。DNA异常甲基化是可使肿瘤抑制基因(TSGs)发生沉默的新型相关研究机制。本研究的主要目的是对非小细胞肺癌细胞株和非小细胞肺癌临床组织样本进行E-cadherin基因启动子区域CpG岛的甲基化状态及其与mRNA表达之间关系的研究,探讨E-cadherin基因的DNA甲基化状态与各种临床病例因素之间的关系。分析3号染色体上8个抑癌基因在肺癌细胞株中的去甲基化效应并探讨其与CpG岛甲基化表型(CpG island methylatorphenotype,CIMP)的关系,为肺癌的临床早期诊断和预后、治疗提供理论依据。
方法:利用通用引物进行巢式PCR的方法对5株NSCLC细胞株和35例NSCLC组织及其相应癌旁组织标本进行E-cadherin基因启动子区域CpG岛甲基化状态分析,再利用DNA测序检测具体CpG岛甲基化位点;同时采用荧光实时定量PCR(Real-Time PCR)方法分析E-cadherin基因的mRNA表达水平;另外在5株NSCLC细胞株中对染色体3p上8个TSGs应用甲基化特异性PCR(MSP)方法进行CIMP分析,检测甲基化抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞甘酸(5-aza-CdR)处理细胞后甲基化状态的变化;同时,利用MTT法分析肿瘤细胞的生长状况。采用Real-TimePCR方法重点分析了hOGGl基因mRNA表达的变化及其与CIMP的关系。
结果:测序结果表明E-cadherin基因启动子区域存在着19个CpG岛甲基化位点,分别分布在翻译起始位点上游-181,-176,-169,-160,-137,-119,-116,-89,-65,-55,-50,-45,-41,-35,-32,-22,-18,-15,-9处。另外我们发现在所有NSCLC细胞株中至少有一个位点发生甲基化。在NSCLC组织样本中E-cadherin基因启动子区域的甲基化频率为28.6%(10/35),且甲基化位点在19个CpG岛呈不同分布形态,在相应癌旁组织中也出现34.3%(12/35)的高甲基化频率;统计分析结果表明E-cadherin基因甲基化状态与非小细胞肺癌组织病理类型、年龄、性别及淋巴结转移之间无显著相关性。在癌组织中发生甲基化的10例样本中有7例发生E-cadherin基因mRNA表达下调,而在未发生甲基化样本中有16例发生甲基化下调:通过5-aza-CdR处理后5株细胞株中有两株甲基化状态发生改变且其mRNA表达有上调,但并不明显。这与NSCLC组织中的结果一致,证明E-cadherin基因mRNA表达可能与甲基化状态无关,P=1.000。
另外在对5株非小细胞肺癌细胞株的药物处理组与空白对照组中分析3号染色体上8个抑癌基因VHL、RAR-b、RASSFlA、FHIT、hMLHl、BLU、SEMA3B及hOGGl基因的甲基化状态和CIMP结果中发现,CIMP结果都为阳性。通过甲基化抑制剂处理后,有3株CIMP结果由阳性转为阴性,细胞形态也发生了变化,细胞发生凋亡,生长受到抑制,并且MTT结果显示加药处理第6天时,这3株细胞生长曲线都明显下降;而另外两株细胞则对药物不敏感,且CIMP无明显变化。令人感兴趣的是,在我们所重点研究的新候选肿瘤抑制基因hOGGl基因中去甲基化作用相对来说最明显,因此我们选取hOGGl基因在5株非小细胞肺癌细胞株的药物处理组与空白对照组中检测mRNA的表达水平,结果发现除一株先前CIMP结果未发生变化的细胞株外,其它4株mRNA表达均发生明显上调,说明hOGGl基因启动子区域的甲基化状态与其mRNA表达显著相关,并且证实了通过去甲基化药物的实施可以使肿瘤抑制基因获得重新表达,恢复抑制肿瘤细胞生长的功能。
结论:我们在NSCLC中发现E-cadherin基因启动子上游区域存在着19个特异甲基化位点,但发现癌和癌旁组织甲基化频率相当,无明显差异,且E-cadherin基因甲基化状态与临床病理特征及mRNA表达均无关,说明E-cadherin基因启动子的异常甲基化可能非癌症特异性。此外,我们发现在体外实验中3号染色体上多个肿瘤抑制基因特定的CIMP与非小细胞肺癌的发展密切相关。hOGGl基因启动子区域的甲基化状态与其mRNA表达显著相关,去甲基化作用药物处理后,抑癌基因的抑制作用重新恢复,这为非小细胞肺癌的临床早期诊断和开发新的化学抗癌药物提供了新的靶点。