论文部分内容阅读
第一部分dMMR/pMMR结直肠癌患者的肠道菌群结构特征【目的】结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一,越来越多的研究表明CRC的发生发展与肠道微生物密切相关。本研究通过将肠道微生物的生态学与肿瘤生物学两个角度结合分析错配修复缺陷（Deficient mismatch repair,dMMR）和错配修复完整（Proficient mismatch repair,pMMR）结直肠癌患者肿瘤组织及其配对癌旁组织样本中的肠道微生物多样性和组成结构特征,寻找不同错配修复状态下CRC患者肠道微生物的特异性优势菌。【方法】本研究收集了230例CRC肿瘤组织和正常邻近部位的配对癌旁组织样本。通过免疫组织化学染色法检测CRC肿瘤组织中错配修复（Mismatch repair,MMR）蛋白的表达水平来确定肿瘤的错配修复基因状态。将患者肿瘤状态分为dMMR（n=29）和pMMR（n=201）。使用试剂盒对所有的肿瘤组织和配对癌旁组织进行细菌16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA,16S r RNA）基因组DNA提取,随后使用靶向细菌16S r DNA功能基因V3-V4高变区域的引物扩增提取的样本DNA,并构建测序文库。原始测序数据经过预处理后进行可操作分类单元（Operational taxonomic unit,OUT）分类和物种注释。通过对物种分类学组成、Alpha多样性指数、Beta多样性、线性判别分析效应大小、物种相互作用关联网络以及肠道菌群功能基因预测等进行生物信息学分析,评估分析dMMR和pMMR CRC肿瘤组织及其配对癌旁组织样本中肠道微生物多样性和组成结构差异变化。【结果】1.dMMR肿瘤组织组的Simpson、ACE和Chao1指数明显高于pMMR肿瘤组织组（P0.05）。4.神经侵犯、有无远处转移、TNM分期和F.nucleatum丰度与患者无进展生存期（progress free survival,PFS）相关。神经侵犯和F.nucleatum丰度（HR=0.452,95%CI:0.275-0.743,P=0.002）是CRC患者预后不良的独立因素。组织学分化程度、肿瘤位置、肿瘤大小、术后病理T分期、有无远处转移和有无癌结节与患者总生存期（Overall survival,OS）相关,其中肿瘤大小、有无远处转移和有无癌结节是CRC患者OS的独立预后影响因素（P<0.05）。【结论】1.F.nucleatum丰度在dMMR CRC患者明显高于pMMR患者,肿瘤组织中丰度也高于癌旁组织;2.dMMR CRC患者的A.muciniphila丰度明显高于pMMR CRC患者,癌旁组织中其丰度降低;3.具核梭杆菌（F.nucleatum）可作为CRC患者生存预后不良因素。第三部分肠道菌群调控免疫微环境在dMMR/pMMR结直肠癌中的影响【目的】分析比较dMMR和pMMR CRC患者肿瘤微环境中免疫细胞的空间分布以及检查点分子的特征,重点探讨了不同错配修复状态下CRC组织样本中的肠道微生物与患者肿瘤免疫微环境中相关免疫指标之间的相关性。【方法】采集dMMR和pMMR CRC患者术前外周血,分析NLR、PLR、LMR、AMC、SII等外周炎症性指标。同时收集了dMMR和pMMR CRC患者的肿瘤组织,通过HE染色检测肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocytes,TILs）浸润情况,采用免疫组织化学染色分析检测肿瘤微环境中肿瘤中心（Center of the tumor,CT）和浸润边缘（Invasive margin,IM）部位的CD8+T细胞、CD3+T细胞不同亚型T淋巴细胞的浸润情况以及免疫检查点分子Siglec-15的表达水平。通过分析dMMR和pMMR CRC患者在不同F.nucleatum和A.muciniphila的丰度水平下,CD8+T细胞、CD3+T细胞浸润的空间分布特征和Siglec-15的表达差异,进一步将dMMR和pMMR CRC外周炎症性指标和肿瘤微环境相关免疫指标与临床病理特征之间进行相关性分析。采用单变量和COX多变量比例风险回归分析模型分析CRC患者的预后因素。使用Spearman等级相关性检验分析外周炎症性指标和肿瘤微环境免疫指标与肠道微生物组之间的相关性。【结果】1.dMMR CRC患者肿瘤组织中TILs、肿瘤中心和浸润边缘部位的CD3+T和CD8+T细胞浸润水平以及免疫评分较pMMR明显升高（P<0.001）。dMMR和pMMR CRC肿瘤组织中浸润边缘部位的CD3+T和CD8+T细胞密度均高于同组织的肿瘤中心T细胞密度（P<0.05）。2.dMMR CRC患者中F.nucleatum低丰度/阴性组的肿瘤中心部位的CD3+T细胞和CD8+T细胞密度均明显高于F.nucleatum高丰度组（P<0.05）。F.nucleatum低丰度/阴性组中肿瘤浸润边缘部位的CD8+T细胞浸润密度明显高于同组织肿瘤中心部位（P=0.042）。在pMMR CRC患者中,F.nucleatum低/阴性和高丰度组中浸润边缘CD3+T细胞和CD8+T细胞密度都比肿瘤中心部位明显增多（P<0.001）。与A.muciniphila高丰度组样本相比,dMMR CRC患者A.muciniphila低丰度/阴性组的肿瘤中心部位的CD3+T细胞密度明显降低（P=0.03）。A.muciniphila高丰度组中肿瘤浸润边缘部位的CD8+T细胞和CD3+T细胞浸润密度明显高于同组织的肿瘤中心部位（P=0.024）。A.muciniphila低丰度/阴性组的肿瘤组织中浸润边缘部位的CD3+T细胞浸润水平比A.muciniphila高丰度组显著降低（P=0.045）。在pMMR CRC患者的肿瘤组织中,A.muciniphila低丰度/阴性和高丰度组的浸润边缘CD3+T细胞和CD8+T细胞密度均高于肿瘤中心部位（P<0.001）。3.dMMR CRC肿瘤中心CD8+T细胞的浸润程度与肿瘤大小（P<0.001）和病理类型（P=0.001）相关。dMMR CRC肿瘤中心部位CD8+/CD3+T细胞比值与肿瘤大小（P=0.045）之间有关,整个肿瘤微环境中CD8+/CD3+T细胞比值与肿瘤大小有着显著的关联（P=0.039）。pMMR CRC肿瘤中心微环境中CD3+T细胞的浸润程度与肿瘤大小（P=0.009）、术后T分期（P=0.002）、TNM分期（P=0.002）、有无远处转移（P=0.034）和有无神经侵犯（P=0.023）有显著的相关性;浸润边缘CD3+T细胞的浸润程度与较晚的TNM分期（P=0.009）、有无肝转移（P=0.024）和有无远处转移（P=0.002）之间存在明显关联。肿瘤中心CD8+T细胞浸润程度与病理T分期（P=0.010）和TNM分期（P=0.029）及神经侵犯（P=0.047）有关;浸润边缘部位CD8+T细胞浸润程度则与TNM分期（P=0.001）、有无肝转移（P=0.024）、有无远处转移（P=0.005）、有无癌结节（P=0.020）及神经侵犯（P=0.033）之间显示有明显的统计学的差异。肿瘤中心微环境中CD8+/CD3+T细胞比值与肿瘤大小有关（P=0.021）。免疫评分与术后病理T分期（P=0.006）、TNM分期（P=0.007）、有无远处转移（P=0.012）和癌结节（P=0.012）存在明显的差异相关性。4.pMMR CRC患者肿瘤微环境中肿瘤细胞显著高表达Siglec-15检查点分子（P0.05）。dMMR CRC患者Siglec-15表达水平与肿瘤病理类型（P=0.006）、淋巴结分期（P=0.001）和TNM分期（P=0.045）之间有显著的相关性。而dMMR CRC组织中Siglec-15表达水平与肿瘤大小（P=0.041）和浸润边缘CD8+T细胞密度（P=0.048）有关。5.肿瘤微环境中肿瘤中心部位CD3+T细胞（P=0.002）、浸润边缘CD8+T细胞（P=0.016）和肿瘤中心CD8+/CD3+T细胞（P=0.006）与患者PFS相关,其中肿瘤中心部位CD3+T细胞（HR=2.647,95%CI:1.516-4.620,P=0.001）是CRC患者独立预后因素。6.CRC患者中F.nucleatum丰度与外周血NLR和SII呈正相关（P<0.05）,而与肿瘤中心微环境中CD3+T细胞（P=0.024）为负相关。pMMR CRC肿瘤组织中A.muciniphila丰度、TILs、肿瘤中心和浸润边缘CD3+T细胞和CD8+T细胞以及免疫评分与F.nucleatum为负相关关系（P<0.05）。Siglec-15表达水平与浸润边缘CD3+T细胞（P=0.025）、浸润边缘CD8+T细胞（P=0.010）呈负相关。在dMMR CRC肿瘤组织中F.nucleatum的丰度与浸润边缘CD8+/CD3+T细胞比值为负相关（P=0.021）。CRC组织中肿瘤中心和浸润边缘的CD3+T细胞、CD8+T细胞以及免疫评分与A.muciniphila的丰度呈正相关关系（P<0.05）。【结论】1.在dMMR和pMMR CRC患者肿瘤微环境中肿瘤中心和浸润边缘CD3+T细胞、CD8+T细胞密度因F.nucleatum和A.muciniphila丰度存在差异;2.Siglec-15免疫检查点分子在pMMR CRC患者中表达上调,提示可能成为候补免疫治疗新靶点;3.CRC中的F.nucleatum和A.muciniphila、错配修复状态和免疫细胞之间是存在相互作用关系。推测在不同错配修复状态下,F.nucleatum在肿瘤微环境中是不同的相互作用模式。