活体光学分子成像不仅可以长时程在体追踪细胞的迁移、聚集和接触等动态行为,还可以直观地呈现细胞内分子信号的动态变化,为在体研究细胞功能提供有力的工具。肿瘤免疫疗法利用免疫系统可以识别并清除肿瘤这一特性来治疗肿瘤,在临床上表现出独特的优势。细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTL）是免疫系统中杀伤肿瘤细胞的主要效应细胞,在清除肿瘤过程中发挥着关键作用。肝脏作为一个具有独特免疫特性的器官,是肿瘤原发和转移的高频区域。然而,在肝脏免疫耐受的微环境下,CTL诱导的肿瘤细胞相关分子事件的动态信息及CTL杀伤肿瘤细胞的能力并不清楚。这个问题的回答将有助于理解活体中CTL清除肿瘤细胞的机制。本文利用活体显微光学成像技术监测了CTL特异性清除实体肿瘤的动态过程,定量分析和比较了肝脏和脾脏内CTL杀伤肿瘤细胞能力,并揭示了CTL杀伤肿瘤过程中肿瘤细胞钙信号和凋亡信号的时序。主要研究结果如下:（1）活体成像监测过继回输CTL浸润肿瘤微环境的运动特性。活体显微光学成像结果显示,无论是在原位肿瘤还是肝转移灶,CTL在表达同源抗原肿瘤内都出现运动速度下降、运动轨迹更加曲折,以及停滞时间更长的现象,这些运动行为有利于CTL识别和杀伤肿瘤细胞。（2）建立了活体动态表征肿瘤细胞分裂增殖与凋亡的可视化研究模型。本文筛选了一系列稳定表达遗传编码型分子探针的黑色素瘤细胞株,用于光学表征肿瘤细胞有丝分裂（H2B-m Cherry）、凋亡（凋亡探针C3）、钙信号（钙探针Twitch2B）的动态变化。进而,建立了活体多色标记的肿瘤可视化模型,用于活体成像研究肿瘤细胞的增殖速率,动态监测CTL特异性识别与杀伤肿瘤过程及相关分子事件变化。（3）根据肿瘤细胞凋亡活体成像结果,定量计算了活体内CTL杀伤肿瘤细胞的能力。在肝脏中CTL的杀伤效率为1.24±0.11个肿瘤细胞/CTL/天,显著低于在脾脏中的杀伤效率（3.18±0.26个肿瘤细胞/CTL/天）。在肝脏中CTL杀伤肿瘤的效率受限,与肝脏组织高表达免疫抑制因子IL-10有关。腹腔注射IL-10中和抗体可以显著提高肝脏中CTL杀伤肿瘤细胞的能力。（4）活体成像揭示CTL诱导的肿瘤细胞钙信号与凋亡信号的时序。CTL杀伤肿瘤细胞导致肿瘤细胞出现钙信号持续升高（>30 s）,这种钙信号升高的时间比细胞内caspase-3的活化早约40 min,提示钙信号的持续升高是诱发凋亡的前提步骤。综上所述,本文运用活体显微光学分子成像监测CTL杀伤肿瘤过程,可视化研究免疫细胞的运动行为和肿瘤细胞关键分子事件的时空特性,建立了活体定量评价CTL杀伤肿瘤细胞能力的方法。研究发现,在肝脏免疫耐受微环境下CTL杀伤肿瘤是一个受限的过程;CTL诱导肿瘤细胞内钙信号持续升高（>30 s）可能是触发caspase-3活化的重要因素之一。本研究为肿瘤的细胞免疫治疗提供了可视化在体评价新方法,有助于揭示CTL在实体瘤应用中的瓶颈问题。