荧光成像具有非物理接触、良好的时间控制性、以及对生物干扰小等优势，成为研究蛋白质的位置、丰度、结构、功能等信息的重要手段，是生命科学研究的重要工具。目前，荧光蛋白和小分子荧光染料是应用最广泛的荧光标签。荧光蛋白标签具有无需外部添加辅因子、特异性强、以及荧光具有“生命”的性质等优势，但是，目前的荧光蛋白种类较少、熟化需要氧气的参与、熟化速度慢、且缺乏时间控制性等不足，在一定程度上限制了荧光蛋白在某些生物研究中的应用。相比而言，小分子荧光染料具有品种丰富、构建无需氧气参与、结构修饰方便，另外，小分子荧光染料还具有明亮的荧光强度、良好的光稳定性和优异的时间可控性等优势，通过化学标签技术或生物正交反应可以实现对目标蛋白的特异性标记，但是其背景高、需要清洗的缺点也极大地限制了它们在活体研究中的应用。针对以上研究现状，本博士论文以分子转子为基础，以限制或消除扭曲型分子内电荷转移(twisted intra-molecular charge transfer,TICT)为突破口，设计合成一系列基于化学标签和小分子荧光染料的荧光标签，实现体内/外蛋白示踪与生物造影，满足不同蛋白功能研究的需要。主要研究内容如下:　　1)基于荧光蛋白桶箍状结构限制生色团转动而特异性发光的特性，人工构建以分子转子为生色团的具有人工合成生色团的荧光蛋白(synthetic fluorescent proteins，SFPs)。首先，以咪唑啉酮衍生物为模型化合物，筛选出与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）桶箍状结构类似的SNAP-tag蛋白，然后，进一步优化分子转子结构，得到可以被蛋白口袋限制TICT机制而特异性发光的生色团，最终得到本底低、特异性强、能够在蛋白水平和细胞水平快速特异性构建的SFP。该荧光蛋白发射485nm的荧光（SFP emitting at485nm，SFP485），具有与增强型青色荧光蛋白(enhanced cyanic fluorescent protein，ECFP)相似的性质，能够用于细胞内生物分子的快速长时间的标记跟踪，荧光性质还与蛋白的结构完整性息息相关，能够作为探针用于研究蛋白蛋白相互作用、研究细胞内钙离子浓度等，具有传统荧光蛋白“生命”的性质。　　2)基于以上SFP构建技术，进一步通过分子工程手段，引入N、O、S的不同供电子基团以及调节共轭结构，得到发射波长更加红移的荧光蛋白。并通过调节共轭基团的连接方式，成功地调节了荧光蛋白的Stock位移，构建了一系列具有不同光学性质的荧光蛋白(SFPs)，实现了发射波长从490nm到660nm跨越整个可见光谱范围，形成量子产率高、激发波长可调的人工荧光蛋白调色板。该荧光蛋白调色板将实现非侵入性、特异性、灵敏性的蛋白示踪、造影，为研究目标蛋白的位置、丰度、功能，以及与其它生物分子之间的相互作用提供了重要的工具，对于了解生命学的奥秘具有非常重要的意义。　　3)基于所构建的SFPs具有优异的特异性、明亮的荧光亮度、和良好的时间控制性的优势，将所设计的小分子探针通过一次转染，分别在哺乳动物细胞内构建不同颜色的SFPs，利用相应生色团的荧光通道对细胞、细胞器进行成像研究。研究证明，这些SFPs可以对丰度不同、环境不同的蛋白进行特异性示踪，并具有良好的时间控制性，实现了对生物大分子原位实时跟踪，完成了区分细胞间隙蛋白、高尔基体定位蛋白的新老蛋白替代过程的可视化;同时，通过配体的更换，实现了同一细胞内的多色成像。另外，活体实验证实所设计的小分子染料可以在活体内成功构建荧光蛋白，实现活体组织的实时造影示踪。　　4)针对传统小分子荧光染料标记蛋白后存在背景高、需要清洗的缺点，以及由目前构建荧光激活型探针的方法构建的探针存在标记速度慢、普适性差等问题，本论文提出通过配体识别蛋白，并利用蛋白邻位巯基与共价加成激活型染料发生Michael加成反应的特点构建荧光激活型探针的方法。通过在香豆素4-位衍生丙烯酰基结构构建成分子转子，使其标记前由于特殊的TICT机制不发荧光，构建了共价加成激活型染料，通过配体识别蛋白后由于蛋白邻位巯基与双键的Michael加成反应消除其TICT机制，从而实现原位激活的蛋白荧光标记。研究表明该激活型荧光标签在以甲氨基碟呤(TMP)和突变的二氢叶酸还原酶(eDHFR:L28C)为配体和蛋白模型体系中，实现了对目标蛋白质快速、特异、共价，以及标记过程无小分子释放的激活型标记，通过在HeLa细胞表达eDHFR:L28C蛋白，实现了细胞内目标蛋白质的特异性快速标记。另外，通过配体的更换，以六组氨酸多肽标签，以及内源性蛋白酪氨酸激酶Btk(Bruton's tyrosine kinase)为蛋白模型，实现了对蛋白标签、多肽标签、内源性蛋白的快速共价永久标记，实现了长时间的荧光跟踪，同时在标记过程中没有小分子基团的释放，消除了对生命过程造成的潜在性威胁。　　5)基于邻位共价激活型探针的概念，通过对有机染料的模块化分子改造，如改变供电子能力、增加发色团的共轭结构等，成功设计合成了一系列具有不同吸收波长的，适用于邻位诱导效应的荧光共价加成激活型染料，实现了荧光探针发射波长从蓝光(455nm)到红光(645nm)的调色板构建。以甲氨基碟呤和二氢叶酸还原酶为模型，验证了该类激活型探针具有共价激活型标记、反应速度快、激活倍数高等优势，同时具有较高的特异性，适用于细胞内不同丰度、位置靶蛋白的标记，也适用于活体靶蛋白的特异性共价标记。