荧光染料作为一类非常重要的发光团,通过所见即所得的方式跟踪和识别目标分子,研究目标生物分子的功能和作用,在荧光分析、生物医学成像等方面有着较为广泛的应用。目前荧光染料根据激发光源不一样可以分为两类:单光子荧光染料和双光子荧光染料。然而很多经典的单光子荧光染料的激发波长处于紫外-可见光区,在生物成像时会产生光漂白、光致毒等问题,组织穿透深度有限,因此在荧光成像方面受到严重限制。与传统的单光子荧光成像相比,双光子荧光成像使用的激光位于近红外区域,具有显著的优势,例如低的光漂白和光致毒性、高分辨率的三维成像以及深的组织穿透能力,从而更适合作为分子工具在生物学研究和疾病诊断等方面使用。次氯酸（HOCl）和过氧化亚硝酰阴离子（ONOO-）是两类常见的氧化性极强的活性氧和活性氮物种,其浓度过高会促发炎症反应和诱导细胞凋亡,继而引起一系列不可逆的损坏。双光子成像在生物体内氧化性物种的监测方面发挥着巨大作用,但是在面对强氧化性物种时,荧光探针的染料骨架容易遭到破坏而造成信号失真。为了满足强氧化性物种的高保真成像需求,本文首先构建了系列具有高稳定性的新型氮杂环双光子荧光染料,并在此基础上发展针对强氧化剂HOCl和ONOO-的成像探针。具体研究内容如下:第一,针对荧光探针的染料骨架容易受到氧化剂破坏而造成信号失真的问题,本论文构建了一类新型氮杂环双光子荧光染料NTP,系统研究其光谱性质,并通过密度泛函理论,对其“构-效关系”进行初步探索。系列光谱性能测试实验表明NTP染料具有优异的单光子和双光子荧光性能。为了评估NTP染料对于氧化剂的稳定性,本文以多种商业染料为参考对象,详细测试不同氧化剂对染料荧光性能的影响,结果发现NTP染料即使在高浓度的氧化剂存在下,仍然能保持较好的荧光性能,而商业染料的荧光发生了较大幅度的减弱。这些特点表明NTP染料有望用于强氧化性物种的高保真双光子成像。第二,鉴于NTP染料具有优异的双光子荧光性能和良好的化学稳定性,本文以NTP染料为荧光团和硫代甲酸酯为识别位点发展了一种新型双光子HOCl探针NTP-HOCl。光谱测试表明探针NTP-HOCl兼具快速响应性和高选择性。生物实验表明探针具有较小的细胞毒性,不仅能用于细胞外源性HOCl的快速成像,也可用于内源性HOCl的高保真双光子成像。此外,该探针也成功用于小鼠乙醇肝损伤模型和肌肉外伤炎症模型中HOCl的双光子成像,这都表明探针对于探究各种病理条件下HOCl的作用与功能有很好的前景。第三,对于氧化性极强的活性氮ONOO-高保真双光子成像,在与之相关的重大疾病的早期诊断以及由ONOO-浓度异常引起的疾病发病机理研究中具有重要意义。本文以NTP染料的双光子性能为基础,结合氧化酰胺的脱保护原理,开发了一种新型的双光子ONOO-探针NTP-ONOO。探针NTP-ONOO具有较小的细胞毒性,能够很快响应ONOO-（＜10 s）。生物实验表明探针可检测细胞外源性和内外源性刺激产生的ONOO-。此外,该探针被进一步的用于CCl4引起肝损伤模型中ONOO-的双光子组织成像,为研究肝损伤发病过程中氧化性物种的变化提供了有效工具。