乳腺癌是全世界女性最常见恶性肿瘤。据最新流行病学数据(GLOBOCAN2012)显示,2012年全球乳腺癌新发病例数约为167万,约占癌症总发病人数的25%。尽管随着诊疗水平的提高,乳腺癌患者的预后获得极大改善,但仍有些患者因病情的异质性及治疗手段的局限性最终出现远位转移而导致死亡。乳腺癌根据分子表型不同主要分为Lumial A型,Lumial B型,HER-2(+)型和基底样型,其中基底样型主要由三阴乳腺癌,即ER(-),PR(-)和HER-2(-)的乳腺癌组成。三阴乳腺癌恶性度高,预后差,虽然患者初治对化疗敏感,但因缺乏有效的治疗靶点及耐药大部分患者最终会在治疗后三年内发生内脏癌转移而死亡。因此,深入研究乳腺癌转移机制,并寻求三阴乳腺癌新的治疗靶点对乳腺癌患者整体预后的改善有重大意义。癌症相关死亡的首要原因为转移,而上皮间质化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)是促进癌转移的关键步骤。EMT不仅参与胚胎形成,在炎症,纤维化及癌症进展中也发挥重要的作用。在癌症发生的早期阶段,一部分肿瘤细胞通过EMT脱离原发肿瘤并进入血液或淋巴循环继而播散至全身,最终在远位通过EMT的逆转形成新发癌灶。该过程包括细胞形态的改变,骨架重排;上皮标记的缺失及间质特征的获得;癌细胞迁移侵袭能力的增强。EMT不仅与癌症进展相关,该过程也是抗癌药物耐药及放疗抵抗的重要机制。因此,EMT的发生与癌症高的恶性度及不良预后密切相关。已有报道指出,三阴乳腺癌细胞具有间质样的特征且发生了EMT,因此探索三阴乳腺癌EMT的相关机制有望发掘新的治疗靶点及新的治疗思路。黑色素瘤相关抗原-MAGEs(Melanoma Antigens),属于肿瘤相关抗原,最初发现于黑色素瘤细胞,后来在多种组织来源的癌细胞中均检测到其表达。根据在染色体的位置和组织分布的差异,MAGEs主要分为I型和II型。MAEG-I由MAGE-A,-B,-C三个家族构成,而MAGE-As是I类抗原中研究较为广泛的家族。mage-as包括a1-a12共12个成员,其在乳腺癌,肝癌,肺癌等一系列不同组织来源的恶性肿瘤中表达,而在除睾丸生殖细胞及胎盘以外的正常组织不表达。mage-as抗原可引起机体cd8+t淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫反应,而且大量研究证实mage-as表达与癌症不良预后有关。因此,mage-as对癌症患者病情评估及靶向治疗均具有重要的意义。有证据显示mage-as的表达与乳腺癌细胞生长和癌转移有关。而且,mage-as在恶性度高、预后差的乳腺癌类型-三阴乳腺癌的表达阳性率高于其它乳腺癌亚型。综上我们推测mage-as的表达可能与三阴乳腺癌高的恶性度及emt有关。为了探索这一问题,实验首先利用免疫组织化学方法(immunohistochemistry,ihc)检测了mage-as及emt相关标记物e钙粘蛋白(e-cadherin),波形蛋白(vimentin)及β-连环蛋白(β-catenin)在乳腺正常组织及乳腺癌组织中的表达,并通过转染sirna的方法下调三阴乳腺癌细胞系mage-as的表达,探索mage-as表达变化对细胞增殖,迁移及侵袭能力等生物学功能影响及可能的作用机制。主要研究内容和结果如下:第一部分mage-as及上皮间质化相关标记物在乳腺癌组织表达的研究目的:检测mage-as在正常乳腺组织及乳腺癌组织中的表达,以及emt相关指标e-cadherin,vimentin及β-catenin在乳腺癌组织的表达,并分析四个基因表达与临床病理参数的关系及mage-as表达与e-cadherin、vimentin、β-catenin表达的关系。方法:首先根据最新的乳腺癌亚型分类标准将乳腺癌组织主要分为三个亚型(luminal型、her-2(+)型、三阴型),分析120例乳腺癌组织中不同亚型的分布情况。然后采用免疫组织化学技术对以下内容进行检测及分析。1检测mage-as在正常乳腺癌组织及乳腺癌组织的表达情况,并比较mage-as在不同亚型乳腺癌的阳性率。2分析mage-as表达及其在细胞中的定位与乳腺癌临床病理学参数的关系。3检测e-cadherin及β-catenin在乳腺癌组织的异常表达率及vimentin的阳性表达率,并比较e-cadherin及β-catenin在三阴型乳腺癌和非三阴型乳腺癌的异常表达率,及vimentin的阳性表达率。4探索e-cadherin及β-catenin的异常表达与vimentin的阳性表达与乳腺癌临床病理学参数的关系。5分析乳腺癌组织中mage-as表达与e-cadherin,β-catenin及vimentin表达的关系。结果:1120例乳腺癌组织中,luminal型,her-2(+)及三阴型所占比例分别是75%,10.83%和14.17%。2mage-as在正常乳腺组织不表达,在乳腺癌组织中表达且阳性率为49.17%(59/120),mage-as在乳腺癌组织中阳性表达率明显高于其在正常组织的阳性表达率(p<0.05)。在不同亚型乳腺癌中,maeg-as在三阴乳腺癌中阳性表达率(76.47%,13/17)明显高于其在her-2(+)型(53.85%,7/13)及lumial型乳腺癌中阳性率(43.33%,39/90)(p<0.05)。在三阴型和非三阴型乳腺癌中,mage-as在三阴型乳腺癌中的表达阳性率高于非三阴型乳腺癌(p<0.05)。3mage-as表达与er(-)、pr(-)、her-2(-)、高的组织学分级、腋窝淋巴结癌转移有关(p<0.05),与其它病理学参数无明显相关性。mage-as在细胞内的定位与临床病理学参数无明显相关性(p>0.05)。4在乳腺癌组织中,e-cadherin的正常表达率为30%,异常表达率为70%,β-catenin的正常表达率为25%,异常表达率为75%;e-cadherin和β-catenin在非三阴型乳腺癌中正常表达率明显高于三阴乳腺癌(p<0.05),二者在三阴乳腺癌的异常表达率高于非三阴型乳腺癌(p<0.05);vimentin在乳腺癌组织的总阳性表达率为34.16%(41/120),其在三阴型乳腺癌中的表达阳性率高于非三阴型乳腺癌(p<0.05)。5在乳腺癌组织中e-cadherin的异常表达与腋窝淋巴结癌转移、脉管瘤栓(+)、er(-)、pr(-)、her-2(-)有关(p<0.05);β-catenin的异常表达与较大的乳腺肿瘤(>2cm),腋窝淋巴结转移,er(-)、高表达的ki-67有关(p<0.05);vimentin的阳性表达与er(-)、pr(-)及腋窝淋巴结癌转移有关(p<0.05)。6在乳腺癌组织中,mage-as的阳性表达与e-cadherin的异常表达及vimentin阳性表达有关(p<0.05),与β-catenin的表达无关(p>0.05)。结论:1mage-as在正常乳腺组织不表达,但在乳腺癌组织表达,且在不同亚型表达阳性率不同,提示可作为新的分子用于乳腺癌亚型分类。2mage-as表达与乳腺癌患者的不良预后有关,且与乳腺癌转移有关。3三阴乳腺癌发生了上皮间质转化,mage-as的表达可能与三阴乳腺癌上皮间质化有关。第二部分mage-as的表达与三阴乳腺癌细胞上皮间质化关系的研究目的:研究mage-as表达与三阴乳腺癌细胞上皮间质化的关系。方法:选取mage-as表达阳性且具有间质特征的三阴乳腺癌细胞系mda-mb-231和bt549进行研究。由于mage-as家族成员结构存在相似性,功能上具有相似性或互补性,因此本部分通过转染mage-asirna下调三阴乳腺癌细胞系中所有mage-as成员的表达,将研究对象分为未转染组(nontransfected),对照组(转染scrambledsirna)及实验组(sirna)三个组进行以下研究。1用rt-pcr及westernblot的方法验证两种细胞系中mage-as表达下调。2采用划痕实验及transwell侵袭迁移实验研究细胞的迁移及侵袭能力变化。3采用mts方法检测细胞的增殖能力4观察细胞的形态变化。5采用realtime-pcr及westernblot的方法检测emt相关分子e-cadherin、β-catenin、vimentin、mmp9的表达变化,及emt相关转录因子snail、slug、zeb1/2及twist的表达情况。6采用免疫荧光方法观察细胞中e-cadherin、β-catenin及vimentin表达量及位置的变化。结果:1两种三阴乳腺癌细胞中mage-as的表达在基因及蛋白水平均被成功敲低。2划痕实验结果显示mage-as表达下调后,三阴乳腺癌细胞24h的水平迁移能力明显下降。mda-mb-231和bt549实验组细胞24h的水平相对迁移率(%)均明显低于未转染组和对照组(p<0.05)。3transwell实验结果显示mage-as表达下调后,三阴乳腺癌细胞24h的垂直迁移能力及侵袭能力明显降低。迁移实验结果显示,mda-mb-231和bt549实验组细胞24h的穿膜细胞数明显低于未转染组和对照组(p<0.05);侵袭实验结果显示,mda-mb-231和bt549实验组细胞24h的穿膜细胞数也明显低于未转染组和对照组(p<0.05)。4mts结果显示mage-as表达下调后随时间延长(0-24-48h),三阴乳腺癌细胞的增殖能力逐渐降低。24h和48h时,mda-mb-231和bt549实验组细胞的od值均明显低于未转染组和对照组(p<0.05);realtime-pcr和wb结果均显示两种三阴乳腺癌细胞中增殖相关基因cyclin-d1和c-myc的表达均随mage-as表达下降而降低。5maeg-as表达下调后,mda-mb-231细胞形态无明显变化,而bt549细胞变小,稍变圆,突触明显消失。6realtime-pcr结果显示,mage-as表达降低后,e-cadherin在mda-mb-231细胞中表达升高(p<0.05),在bt549细胞无明显变化(p>0.05),vimentin和mmp9在两种细胞中均表达下降(p<0.05),β-catenin表达无明显变化(p>0.05);westernblot结果显示,随mage-as表达下调,两三阴乳腺癌细胞中e-cadherin表达均无明显变化(p>0.05),β-catenin、vimentin、mmp9表达均下降(p<0.05)。7免疫荧光结果显示:mage-as表达下调后,两三阴乳腺癌细胞中e-cadherin表达无明显变化;β-catenin在胞膜无表达,主要在胞核表达,胞浆少量表达,且随mage-as表达下调表达降低;vimentin在胞核和胞浆均表达,且随mage-as表达下调表达减少。8realtime-pcr结果显示在mda-mb-231细胞中slug及twist表达无明显变化(p>0.05),而snail、zeb1/2表达均下降(p<0.05);bt549细胞中snail表达不变(p>0.05),slug、zeb1/2及twist表达均下降(p<0.05)。westernblot结果显示,mda-mb-231细胞中snail、zeb1/2表达均明显下降(p<0.05),slug表达升高(p<0.05),twist表达不变(p>0.05);bt549细胞中snail及twist表达不变(p>0.05),slug、zeb1/2表达均下降(p<0.05)。结论:1mage-as表达下调后抑制了三阴乳腺癌细胞的迁移、侵袭及增殖能力。2mage-as表达降低使三阴乳腺癌细胞emt发生部分逆转。3mage-as对三阴乳腺癌细胞emt的调节可能通过zeb1及zeb2介导。第三部分mage-as调节三阴型乳腺癌细胞上皮间质化机制的研究目的:研究mage-as调节三阴型乳腺癌细胞上皮间质化的作用机制。方法:1用realtime-pcr和wb方法检测并比较三阴乳腺癌细胞mda-mb-231和bt549的未转染组、对照组及实验组中wnt/β-catenin信号通路下游靶基因cyclin-d1、c-myc和mmp7的表达变化。2用wb方法检测并比较三阴乳腺癌细胞mda-mb-231和bt549的未转染组、对照组及实验组中gsk-3β/p-gsk-3β(ser9)的表达变化。以下内容的研究用gsk-3β拮抗剂同时也是wnt/β-catenin通路激活剂sb216763处理mda-mb-231和bt549三阴乳腺癌细胞的对照组和实验组并进行检测分析。3采用划痕实验和transwell侵袭和迁移实验检测两种三阴乳腺癌细胞的对照组和实验组用药物处理前后迁移和侵袭能力的变化。4用mts法检测两种三阴乳腺癌细胞的对照组和实验组用药物处理前后增殖能力的变化。5观察两种三阴乳腺癌细胞的对照组和实验组用sb216763处理后的形态变化。6用wb方法检测两种三阴乳腺癌细胞实验组和对照组细胞用药前后e-cadherin、β-catenin、vimentin、mmp9及snail、slug、zeb1/2及twist的表达变化。7用wb方法检测并比较两种三阴乳腺癌细胞对照组和实验组用药前后cyclin-d1、c-myc和mmp7的表达变化。结果:1mage-as表达下调阻断了三阴乳腺癌细胞的wnt/β-catenin信号通路。realtime-pcr及wb结果均显示,在两种三阴乳腺癌细胞中,实验组cyclin-d1、c-myc和mmp7表达水平较未转染组和对照组均明显降低(p<0.05)。2mage-as表达下调导致三阴乳腺癌细胞gsk-3β表达升高,p-gsk-3β表达降低。westernbolt结果显示,在两种三阴乳腺癌细胞中,gsk-3β蛋白在实验组的表达明显高于未转染组和对照组(p<0.05);而p-gsk-3β在实验组的表达较未转染组和对照组均降低(p<0.05)。3sb216763使三阴乳腺癌细胞被抑制的迁移侵袭能力逆转。划痕和transwell迁移侵袭实验结果显示,sb216763作用于两种三阴乳腺癌细胞后,对照组迁移侵袭能力明显增强,实验组原被抑制的迁移侵袭能力也再次升高。4sb216763使三阴乳腺癌细胞被抑制的增殖能力逆转。mts结果显示,sb216763处理两种三阴乳腺癌细胞后,对照组细胞在24h和48h的吸光度值均明显升高,实验组细胞原被抑制的吸光度值也再次升高。5sb216763使三阴乳腺癌细胞被抑制的上皮间质化逆转。sb216763作用于mda-mb-231细胞的对照组和实验组后,细胞间质形态更明显,bt549对照组细胞间质形态也更明显,实验组细胞由圆形再次变为长梭形,间质形态恢复。wb结果显示sb216763作用后,e-cadherin表达在mda-mb-231对照组细胞明显下降(p<0.05),在bt549对照组细胞无明显变化(p>0.05),而vimentin、β-catenin及mmp9表达在两三阴乳腺癌细胞对照组均明显升高(p<0.05);两三阴乳腺癌细胞实验组e-cadherin表达无明显变化(p>0.05),原降低的vimentin、β-catenin及mmp9表达均再次升高(p<0.05)。zeb1/2在两三阴乳腺癌细胞的对照组用药物处理后表达明显升高,而实验组原降低的zeb1/2表达也再次升高(p<0.05)。6sb216763使被抑制的wnt/β-catenin信号通路再次激活。wb结果显示,sb216763作用于两种三阴乳腺癌细胞后,对照组中wnt/β-catenin下游的靶分子cyclin-d1、c-myc和mmp7蛋白表达升高,实验组原降低的cyclin-d1、c-myc和mmp7蛋白表达也升高(p<0.05)。结论:1 MAGE-As表达下调使三阴乳腺癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路阻断。2 GSK-3β抑制剂SB216763作用于MAGE-As表达下调的三阴乳腺癌细胞使原被抑制的上皮间质化逆转。3 MAGE-As部分通过GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路对三阴乳腺癌细胞的上皮间质化进行调节。