研究背景及目的意义皮肤在机体稳态的维持中发挥着重要作用，它可使机体免受物理性、化学性、机械性以及病原微生物的侵袭，还可以帮助机体的内环境保持稳定。严重烧伤后，皮肤的完整性遭到破坏，屏障作用丧失，且极易感染。感染后的创面会成为机体全身感染的重要来源。烧伤创面的治疗情况可在极大程度上影响患者病情变化，故对于严重烧伤的患者而言，尽快封闭创面是治疗的重要环节。在创面修复过程中，角质细胞移行不仅是创面再上皮化的起始事件，也是其限速步骤[1]，而角质细胞的增殖则确保移行不断进行，上皮-间充质转化的发生使细胞运动能力增加，有利于细胞向创面迁移，故角质细胞的生物学行为在封闭创面中发挥了重要作用。众所周知，严重烧伤后，无论是局部还是全身均可发生缺血缺氧。“休克心”的发生使机体有效循环血容量锐减，组织灌流不足，机体处于缺血缺氧的状态。在此基础上，由于创面局部血管毁损、感染和呼吸爆发等造成耗氧量增加，所以创面周围也处于低氧环境。临床现象提示，包扎等短暂低氧环境可以提高创面愈合速度[2-4]，长期低氧则可造成创面不愈，慢性创面进行高压氧治疗也可加快创面愈合[5-7]，这提示氧浓度阈值与作用时间阈值对创面修复细胞的行为有重要影响。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是机体内重要的信号分子，在细胞生长、分化、凋亡等方面都发挥着重要作用[8-11]，其两种复合物mTORC1、mTORC2分别调节细胞生长和运动。许多研究表明缺氧会抑制mTOR信号通路，但是多种肿瘤组织在处于低氧环境的同时，其mTOR仍处于激活状态，并与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关[13-15]。鉴于创面愈合和肿瘤发生之间的相似性[16-20]及该信号通路在机体中的普遍性和重要性，mTOR通路在低氧环境下的创面愈合中处于何种状态，以及在再上皮化的过程中发挥了何种作用，均尚无文献进行系统的报道，值得进行研究。除了负压装置的临床应用外，目前的研究都集中在体外低氧对创面愈合细胞生物学行为的影响，缺少实验结果的在体应用。有文献利用两种对氧气通透率差别很大的薄膜对创面进行覆盖[21]，封闭7天，记录创面氧分压的动态变化，发现持续的低氧环境(7天)使得动物创面修复速度下降，愈合减缓。我们利用该参考文献低氧模型制作方法并结合低氧作用的理论机制，考虑适当缩短体外低氧处理的时间，观察短时间低氧处理对创面愈合的影响，找到促进创面修复的低氧时间阈值，最终使之应用于临床。为了达到这一研究目的，我们在明确体外低氧作用的时间阈值对创面修复过程中细胞行为影响的基础上，进一步利用在体低氧模型研究低氧对创面修复的影响，使之为临床促进创面修复提供新的参考。材料与方法1、创面周围低氧及细胞增殖情况制作小鼠全层皮肤缺损模型，伤后1d、2d、3d、4d、7d、10d、14d取材，制作冰冻切片后，利用HypoxyprobeTM-1Plus Kit做免疫荧光染色，红色荧光即代表低氧区域。用Image-Pro Plus软件分析图片，观察创面周围低氧的分布位置、程度、随时间变化情况，通过免疫组化法染PCNA研究创面周围细胞增殖情况。2、小鼠原代表皮细胞的分离与培养取Balb/c乳鼠的皮肤，用DispaseⅡ溶液4°C过夜消化，次日用0.25%胰酶在37°C消化5-10min，期间不断吹打，过滤除去皮肤碎片，离心后重新致悬，吸取10μL细胞混悬液计数，调整细胞密度后将混悬液分装至T25培养瓶中，置于37°C、5%CO2培养，注意观察细胞生长形态、培养基颜色、浑浊度等情况。3、短时间低氧处理对细胞运动能力、迁移能力的影响按照常规操作培养、消化HaCaT细胞(人表皮细胞株)后接种，并按照随机数字表法分为对照组、低氧1h、3h、6h组，每组样本数为6，每孔观察细胞数不少于30。利用活细胞工作站实时观察记录各组细胞的运动情况，Image J软件描绘出细胞运动轨迹，并统计数据分析细胞运动能力的变化。接种HaCaT细胞后，根据随机数字表法将细胞分为对照组、1h、3h、6h组，每组样本数为8，用200μL的移液枪枪头在培养孔底部均匀用力划痕，进行相应低氧处理后继续置于C02培养箱中培养，定时在显微镜下观察并记录拍照。4、低氧处理对细胞增殖的影响(1)按照常规操作消化HaCaT细胞后接种在96孔板中，根据随机数字表法将其分为对照组、低氧1h、3h、6h、9h、12h、24h组，每组有20孔，Cell Counting Kit-8(CCK8)法检测各孔吸光度值，研究细胞增殖情况。(2)将HaCaT细胞随机分为对照组、1h、3h、6h、24h组，每组样本数为5，蛋白免疫印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)。5、低氧处理对原代细胞发生上皮-间充质转化(EMT)转化的影响分离培养小鼠原代表皮细胞，按照随机数字表法分为对照组、低氧0.5h、1h、3h、6h、24h组，每组样本数为6，Western Blot法检测波形蛋白的表达变化；利用免疫细胞荧光法对对照组、低氧24h组进行染色，观察波形蛋白的表达，同时免疫荧光染F-actin，观察其分布及状态。6、低氧对Akt、P70S6K及mTOR蛋白表达的影响常规培养原代细胞后接种在培养皿中，根据随机数字表把它们分为对照组、低氧10min、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h组，每组有6个样本。Western Blot法检测Akt、P70S6K、mTOR磷酸化程度及细胞中总的P70S6K、mTOR蛋白表达水平。7、低氧处理对在体创面的影响Balb/c小鼠脱毛后制作背部全层皮肤缺损模型，根据随机数字表将实验动物分为对照组、低氧1h、3h、6h组，每组至少有5只。将氧气通透率极低的polyvinylidenechloride(聚偏二氯乙烯)覆盖小鼠背部左侧的创面，营造低氧环境，将氧气可自由通过的polymethylpentene(聚甲基戊烯)膜覆盖右侧的创面作为其对照进行研究。处理完毕后即除去覆盖的薄膜，将创面暴露在空气中，观察记录小鼠创面愈合情况，利用Image-Pro Plus软件分析，根据实验目的需要适时取材。以低氧处理6h组为例，利用HE染色、Masson染色、免疫组化染色观察低氧处理创面与对照组的区别。结果1、创面周围低氧出现的位置、程度及时间依赖关系创面形成2天后，创缘即可出现红色荧光，说明创缘此时即处于缺氧状态，第3天时最为明显。随着时间的延长，红色荧光强度逐渐减弱。创缘、创面移行的细胞可见棕黄色的阳性表达，说明表皮细胞增殖活跃。2、小鼠原代表皮细胞的分离与培养结果原代细胞生长良好，24h左右开始贴壁，细胞呈圆形或椭圆形，体积较大，胞核体积也较大，细胞生长旺盛，轮廓清晰，折光性好，呈铺路石样状态，为下一步实验奠定了基础。3、短时间低氧处理对细胞运动和迁移能力的影响3.1细胞运动距离：对照组细胞运动轨迹较集中，少有运动范围较大的细胞，低氧1h、3h、6h组的细胞运动范围依次增大，低氧6h组增加幅度最大。对照组、低氧1h、3h、6h组平均运动距离分别为(100.320±43.102)μm、(129.144±48.139)μm、(134.828±43.005)μm、(169.183±54.588)μm。3.2细胞运动速度：观察1h时，低氧1h、3h、6h组细胞轨迹速度分别为(43.315±18.429)、(43.965±16.305)、(55.005±19.471)μm/h，高于正常对照组的(33.832±13.450)μm/h (t=2.840~7.468，P<0.05或0.01)，低氧6h组显著高于低氧1h、3h组(t值分别为3.678、3.924，P<0.05或0.01)。观察2h时，低氧1h、3h、6h组细胞轨迹速度分别为(43.625±17.380)、(43.509±13.732)、(54.465±17.201)μm/h，高于正常对照组的(33.011±11.667)μm/h (t=3.936~8.465，P<0.01)，低氧6h组显著高于低氧1h、3h组(t值分别为3.474、4.043，P<0.05或0.01)。观察3h时，低氧1h、3h、6h组细胞轨迹速度分别为(43.048±16.046)、(44.943±14.335)、(56.394±18.196)μm/h，高于正常对照组的(33.440±10.23)μm/h(t值=3.600~9.330，P<0.01)，低氧6h组显著高于低氧1h、3h组(t值分别为4.545、4.475，P<0.01)。正常对照组、低氧1h、3h、6h组在不同时相点轨迹速度比较无差异(t=-0.523~0.596，P值均大于0.05)。观察1h时，低氧1h、3h、6h组细胞位移速度分别为(22.295±11.374)、(19.445±13.732)、(31.555±19.12)μm/h，高于正常对照组的(15.219±9.985)μm/h (t=1.990~6.976，P<0.05或0.01)，低氧6h组显著高于低氧1h、3h组(t值分别为3.394、5.194，P<0.05或0.01)。观察2h时，低氧3h、6h组细胞位移速度分别为(12.156±7.687)、(20.533±12.747)μm/h，显著高于正常对照组的(8.801±6.654)μm/h (t值分别为2.386、8.000，P<0.05或0.01)，低氧6h组显著高于低氧1h、3h组(t值分别为5.955、5.732，P<0.01)。观察3h时，低氧3h、6h组细胞位移速度(9.884±6.411)、(17.051±11.743)μm/h，显著高于正常对照组的(6.427±5.295)μm/h (t值分别为2.808、8.231，P<0.01)，低氧6h组显著高于低氧1h、3h组(t值分别为6.008、5.558，P<0.01)。比较不同时相点位移速度,各组差异均有统计学意义。在观察2h时，各组速度比观察1h时显著降低(t值=-7.036~-4.232，P均小于0.01)；观察3h时，各组速度比观察1h时显著降低(t=-8.208~-5.540，P均小于0.01)，正常对照组观察3h时比2h时下降(t=-1.967，P<0.05)。3.3划痕实验：体外低氧处理1h、3h、6h均可促进细胞的侧向迁移，并且随着低氧处理时间的增加，其侧向迁移趋势也增大，以6h最为明显。4、低氧处理对细胞增殖的影响4.1CCK8法检测结果：对照组、低氧1h、3h、6h、9h、12h、24h组吸光度值分别为1.110±0.069、1.358±0.099、1.387±0.047、1.379±0.049、1.104±0.14、1.063±0.089、0.992±0.064(F=39.19，P<0.01)。与对照组相比，低氧1h、3h、6h组细胞增殖水平显著增加(t=6.639~7.403，P<0.01)，低氧24h组细胞增殖水平降低(t=-3.135，P<0.05)。低氧24h、12h、9h组显著低于低氧1h、3h、6h组(t=-10.538~-6.775，P<0.05或0.01)。4.2Western Blot法检测结果：对照组、低氧1h、3h、6h、24h细胞PCNA蛋白表达量为0.926±0.121、0.972±0.142、1.621±0.18、0.945±0.09、0.661±0.21(F=20.11，P<0.01)。低氧1h、3h、6h组细胞PCNA蛋白水平较对照组显著增高(t=2.235~5.783，P<0.05或0.01)；低氧24h组蛋白表达量较对照组降低(t=-1.998，P<0.05)。低氧3h组蛋白水平明显高于低氧1h、6h组(t值为4.312、3.947，P<0.01)5、低氧处理对原代细胞发生上皮-间充质转化(EMT)的影响低氧环境处理后，免疫细胞荧光显示表达波形蛋白的细胞数目增多，表达量增加。Western Blot结果显示，对照组和低氧30min、1h、3h、6h及24h组波形蛋白表达量分别为0.319±0.09、0.983±0.22、1.03±0.11、1.392±0.43、1.329±0.13、1.317±0.14。免疫荧光显示F-actin表达增多，向细胞周边聚集转移，形成较多的应力纤维、板状伪足，呈卫星状分布在细胞边缘。6、低氧对Akt、P70S6K和mTOR的影响6.1磷酸化的Akt：在对照组和低氧处理10min、30min、1h、3h、6h、12h和24h组，磷酸化Akt蛋白表达量分别为0.666±0.035、1.845±0.111、2.132±0.452、2.963±0.161、2.263±0.494、0.886±0.171、0.377±0.084、0.142±0.093。6.2P70S6K：在对照组和低氧处理10min、30min、1h、3h、6h、12h和24h组，磷酸化的P70S6K蛋白表达量分别为0.744±0.156、1.771±0.312、1.639±0.374、2.013±0.227、1.791±0.484、1.679±0.231、0.549±0.197、0.268±0.066，蛋白样本中总的P70S6K的表达量基本保持不变，各组分别为1.05±0.369、1.435±0.283、1.151±0.214、1.549±0.472、1.578±0.17、1.348±0.724、0.603±0.226、0.657±0.361。6.3mTOR：磷酸化的mTOR(Ser2481)在对照组和各个处理组中表达量分别为0.62±0.190、1.133±0.286、1.5±0.298、1.967±0.473、1.931±0.449、1.876±0.324、0.878±0.342、0.22±0.082，同时细胞中总的mTOR在对照组和各个处理组中表达量为0.865±0.051、1.003±0.122、0.961±0.226、1.410±0.242、1.517±0.289、1.468±0.185、0.9±0.298、0.92±0.42。7、低氧处理对在体创面愈合过程的影响于创面形成后24-48h(含缺氧时间)观察创面面积，发现创面经低氧处理1h、3h、6h后，剩余面积均较对照组小，并在愈合过程中保持此趋势。以低氧处理6h创面为例，HE染色显示低氧处的表皮厚度较常氧处明显增加，PCNA免疫组化染色可见同一时间点低氧组处于增殖期的细胞数目较多。Masson染色见两组创面处的胶原纤维较多，粗细不等，排列致密紊乱，周围被均质化的基质包围，未见明显差异。HE染色、Masson染色可见到低氧组皮下的血管密度较高。讨论与结论1、本研究结果显示，创面形成后第2天创缘出现缺氧状态，伤后第3天达到高峰。创缘表皮细胞增殖活跃，与创面缺氧分布的区域一致，从创缘移行到创面的表皮细胞也处于活跃的增殖状态。2、短时间低氧处理可以促进细胞运动能力明显增加。活细胞工作站观察结果显示，短时间低氧处理可以促进细胞运动能力明显增加，低氧6h处理的增加幅度最大。划痕实验结果显示，体外低氧处理可以促进角质细胞的侧向迁移，处理6h迁移距离最大，此结果和活细胞工作站的数据一致。3、短时间低氧处理可促进细胞增殖和EMT转化，延长低氧时间可使细胞增殖受抑。CCK8法发现短时间低氧处理(1h、3h、6h)均促进细胞的增殖，低氧时间延长到9h、12h、24h后细胞增殖减缓甚至受到抑制， Western Blot显示低氧1h、3h、6h促进细胞增殖，低氧24h抑制细胞增殖；免疫细胞荧光、Western Blot结果显示，低氧处理后原代表皮细胞波形蛋白的表达增加，F-actin分布位置及状态发生改变，提示低氧可以促进EMT转化。4、短时间低氧处理引起mTOR信号激活，可能是体外低氧刺激表皮细胞使其生物学行为发生改变的机制。Western Blot结果显示，短时间低氧处理(30min、1h、3h、6h)引起mTORC1、mTORC2信号激活，随着低氧时间的延长其激活水平逐渐下降，低氧处理24h会抑制该信号通路。5、动物实验结果显示，创面短时间低氧处理可使增殖活跃的细胞增多，血管密度增加，愈合速度加快。低氧处理的创面愈合后表皮厚度增加， PCNA免疫组化染色可见创面增殖活跃的细胞增多； HE染色和Masson染色可见低氧创面的血管密度较高；创面低氧处理1h、3h、6h后，创面愈合速度加快。但两者胶原纤维未见明显不同。6、上述研究结果对阐明烧伤创面修复乃至其他创面修复的机制提供了新的参考，并为探讨临床创面修复新方法提供了实验基础。