脾气虚大鼠糖吸收障碍及四君子汤疗效机制的研究

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目的:观察四君子汤、人参皂苷Re及人参多糖对脾气虚证模型大鼠小肠及Caco-2细胞葡萄糖吸收功能的影响。探讨其改善小肠上皮细胞细胞膜上葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)转运葡萄糖的功能、作用于GLUT2蛋白及mRNA表达的机制;寻找其影响葡萄糖吸收可能的作用途径及位点。  方法:脾气虚证大鼠模型建立:利血平模型采用颈部皮下注射利血平,注射剂量为0.33mg/mL/kg/d(雌性),0.4mg/mL/kg/d(雄性),同时参考体重范围,确定利血平注射剂量和时间;大黄模型为灌服200%大黄浓缩液,6mL/只/d,视大鼠状态变化,选择14d的造模时间。通过观察一般症状表现,结合检测尿D-木糖排泄率,评价脾气虚证大鼠模型及小肠对单糖的吸收功能。  四君子汤治疗作用研究:脾气虚证模型建立后,将模型组分为自然恢复组和四君子汤治疗组,观察一般症状表现、检测尿D-木糖排泄率,利用在体肠灌流技术,灌流葡萄糖溶液,收集并检测葡萄糖的含量。并通过采集小肠粘膜,检测GLUT2蛋白及mRNA表达量的变化,观察四君子汤在改善脾气虚证模型大鼠葡萄糖吸收方面的作用。  Caco-2细胞葡萄糖吸收模型建立:六孔培养板体外培养 Caco-2细胞,细胞长满至21d时用于实验,用75mM浓度葡萄糖孵育刺激10min。  人参皂苷Re和人参多糖作用观察:将分别含根皮苷、根皮素、人参皂苷Re和人参多糖的75mM葡萄糖溶液,加入到Caco-2细胞葡萄糖吸收模型中,孵育刺激10min,观察根皮素和根皮苷对葡萄糖吸收功能的影响、人参皂苷Re和人参多糖对Caco-2细胞葡萄糖吸收的作用,及在根皮素或根皮苷存在的前提下,人参皂苷 Re和人参多糖对Caco-2细胞葡萄糖吸收的作用。  结果:利血平和大黄所致脾气虚证模型组大鼠造模结束时均出现饮食减少、消瘦、毛色萎黄、倦怠懒动、泻下便溏、喜扎堆等系列脾气虚的表现;模型组大鼠尿D-木糖排泄率低于正常对照组大鼠,小肠对单糖的吸收水平下降,结合以上分析,所建立的脾气虚证大鼠模型适合本实验研究。模型建立之后,与正常对照组比较,模型组大鼠葡萄糖吸收量下降;GLUT2蛋白及mRNA表达显著下降。经过四君子汤治疗后,尿D-木糖排泄率、葡萄糖吸收量、GLUT2蛋白及mRNA表达均高于模型组。  通过 Caco-2细胞葡萄糖吸收模型观察葡萄糖吸收功能情况时,与正常对照组比较,经人参皂苷Re和人参多糖刺激后,25μM和50μM浓度人参皂苷Re能够显著促进葡萄糖吸收;人参多糖效果不明显。与正常对照组比较,根皮素和根皮苷能够显著抑制葡萄糖吸收;与根皮素组比较,50μM浓度人参皂苷Re能够扭转根皮素的抑制作用,促进葡萄糖的吸收,人参多糖无明显作用;与根皮苷组比较,100μM人参皂苷 Re和高剂量人参多糖能够加重根皮苷的抑制作用,抑制葡萄糖的吸收。  Caco-2细胞葡萄糖吸收模型中GLUT2蛋白及mRNA表达变化:与正常对照组比较,根皮素能够显著抑制 GLUT2蛋白表达及 mRNA表达;50μM浓度人参皂苷Re和高剂量人参多糖均能够扭转根皮素对GLUT2蛋白及mRNA表达的抑制作用,促进GLUT2蛋白及mRNA的表达。  结论:利血平和大黄所致脾气虚证大鼠模型,经过观察一般症状表现,并主要结合检测尿D-木糖排泄率,发现均适用于小肠葡萄糖吸收的药理学研究;健脾方药四君子汤能够改善脾气虚证模型大鼠葡萄糖吸收的功能,增加小肠粘膜GLUT2蛋白及mRNA的表达,提示其可能存在的作用途径及调节位点与GLUT2相关。Caco-2细胞葡萄糖吸收模型适合用于观察葡萄糖的吸收情况,根皮素和根皮苷对葡萄糖吸收的抑制,能够稳定模拟脾气虚证小肠对葡萄糖的吸收状态,适用于开展药理学模型研究。50μM人参皂苷Re能够促进葡萄糖吸收功能恢复,改善葡萄糖吸收障碍;100μM人参皂苷Re和高剂量人参多糖能够提高受根皮素抑制的GLUT2蛋白及mRNA表达水平。
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