目的 骨肉瘤发生于骨骼或其附属组织,是恶性程度较高的骨的原发性肿瘤。骨肉瘤的早期症状为疼痛,随着病情的进展,骨肉瘤会诱发肿块、功能障碍、骨折等,导致患者的健康情况逐渐下降,乃至后期出现多数病人肿瘤转移,全身机体衰竭。骨肉瘤的发病机制尚未完全明确。目前普遍认为的诱发肿瘤的生理原因之一是慢性炎症,而在慢性炎症的发生发展过程中,环氧化酶,尤其是COX家族中的COX-2扮演着重要的角色,由于COX-2在炎症中的特殊地位,“COX-2表达变化→慢性炎症→肿瘤”这条通道已经成为了肿瘤研究的热点之一,现有的实验研究结果表明,COX-2表达变化和许多种类肿瘤的发生发展密切相关,在肿瘤的发生和发展过程中,向上表达的环氧化酶-2(COX-2)扮演着重要的调控角色,多数肿瘤的发病过程都伴随着COX-2的逐步上调。随着对基因的研究进入microRNA阶段,又有学者研究发现miR-143的表达上调可抑制COX-2的表达,最终抑制肿瘤细胞的形成、增值和转移。但是在骨肉瘤的基础和临床研究过程,miR-143对骨肉瘤细胞和骨肉瘤组织中的COX-2调控作用鲜有报道。本研究利用qRT-PCR和Western blot技术检测COX-2在骨肉瘤患者血液和肿瘤组织中表达情况,qRT-PCR技术检测miR-143在在骨肉瘤患者血液和肿瘤组织中表达情况,探讨COX-2和miR-143在骨肉瘤患者肿瘤组织和血液中表达情况,验证miR-143与患者病情恶化程度、COX-2表达的关系,以期为骨肉瘤的早期诊断或临床治疗提供研究的理论依据。方法 以我院2011年12月-2013年12月收治的确诊的骨肉瘤患者为研究对象,参照WHO 2002年骨肿瘤分类,骨肉瘤外科分期诊断标准参照骨和软组织恶性肿瘤的1980年Enneking分期,实际也是根据GTM进行分期,Ⅰ期是低度恶性肿瘤,Ⅱ期是高度恶性肿瘤,发生转移的病例都属于Ⅲ期。收集标本分成两部分：一部分为受试者清晨空腹采集的外周血,分离出血清部分送液氮低温保存待测；一部分为切除的骨肉瘤组织,离肿瘤原发灶5cm以上的地方取阴性癌旁组织,送液氮低温保存待测。血液标本共分为骨肉瘤Ⅰ期组22人、骨肉瘤Ⅱ期组18人、骨肉瘤Ⅲ期组6人和正常健康体检者组(对照组)26人(选自研究期间来我院体检的正常身体健康者,确认为非肿瘤患者)共4个组,其中骨肉瘤Ⅰ期组男性16例,女性6例,年龄区间为12-26岁,平均年龄18.6±3.7岁；骨肉瘤Ⅱ期组男性12例,女性6例,年龄区间为11-27岁,平均年龄19.8±4.8岁；骨肉瘤Ⅲ期组男性1例,女性5例,年龄区间为15-23岁,平均年龄18.1±2.9岁；对照组男性16例,女性10例,年龄区间为10-28岁,平均年龄18.8±5.0岁。收集血液标本期间,收集在我院进行外科手术切除的骨肉瘤标本,共20例。其中骨肉瘤Ⅰ期标本组织9例,男性6例,女性3例,年龄区间为13-25岁,平均年龄17.6±±4.0岁；骨肉瘤Ⅱ期标本组织8例,男性2例,女性6例,年龄区间为11-20岁,平均年龄16.4±2.8岁；骨肉瘤Ⅲ期标本组织3例,男性2例,女性1例,年龄区间为15-20岁,平均年龄17.3±2.5岁；以阴性的癌旁组织作为对照组。所有的样本收集均经过了医院伦理委员会的批准,并签署了知情同意书。采用qRT-PCR和Western Blot检测血液和肿瘤组织COX-2因子的mRNA表达变化和相应的蛋白表达变化,qRT-PCR检测血液和肿瘤组织中miR-143的表达变化。所有数据均用SPSS18.0统计软件包进行处理,计量数据以均数±标准差(x±s)表示,资料进行正态性检验；各骨肉瘤组之间计量资料采用one-way ANOVA,方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’s T3法。P<0.05认为差异有统计学意义。结果骨肉瘤组织标本中,采用qRT-PCR检测的COX-2 mRNA的相对表达量分别是：骨肉瘤Ⅰ期1.52±0.07,骨肉瘤Ⅱ期2.75±0.14,骨肉瘤Ⅲ期3.47±0.12。三期骨肉瘤组分别相对于对照组,肿瘤组织标本中COX-2的mRNA表达均显著上调(P<0.05)。骨肉瘤Ⅲ期组肿瘤组织标本中COX-2的mRNA表达高于骨肉瘤Ⅰ期组和骨肉瘤Ⅱ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)；骨肉瘤Ⅱ期组肿瘤组织标本的COX-2的mRNA表达高于骨肉瘤Ⅰ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)。骨肉瘤组织标本中,采用Western blot检测的COX-2蛋白的相对表达量分别是：骨肉瘤Ⅰ期2.01±0.14,骨肉瘤Ⅱ期3.26±0.11,骨肉瘤Ⅲ期3.83±0.16。三期骨肉瘤组分别相对于对照组,肿瘤组织标本中COX-2蛋白的表达均显著上调(P<0.05)。骨肉瘤Ⅲ期组肿瘤组织标本中COX-2蛋白的表达高于骨肉瘤1期组和骨肉瘤Ⅱ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)；骨肉瘤Ⅱ期组肿瘤组织标本的COX-2蛋白的表达高于骨肉瘤Ⅰ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)。骨肉瘤血液标本中,采用qRT-PCR检测的COX-2 mRNA的相对表达量分别是：骨肉瘤Ⅰ期1.07±0.15,骨肉瘤Ⅱ期1.75±0.16,骨肉瘤Ⅲ期2.05±0.11。骨肉瘤Ⅱ期、Ⅲ期组分别相对于对照组,血液标本中COX-2的mRNA表达均显著上调(P<0.05),骨肉瘤Ⅰ期组相对于对照组,血液标本中COX-2的mRNA表达无显著的统计学意义(P>0.05)。骨肉瘤Ⅲ期组血液标本中COX-2的mRNA表达高于骨肉瘤Ⅰ期组和骨肉瘤Ⅱ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)；骨肉瘤Ⅱ期组血液标本中的COX-2的mRNA表达高于骨肉瘤Ⅰ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)。骨肉瘤血液标本中,采用Western blot检测的COX-2蛋白的相对表达量分别是：骨肉瘤Ⅰ期1.06±0.13,骨肉瘤Ⅱ期1.81±0.15,骨肉瘤Ⅲ期2.47±0.14。骨肉瘤Ⅱ期、Ⅲ期组分别相对于对照组,血液标本中COX-2的蛋白表达均显著上调(P<0.05),骨肉瘤Ⅰ期组相对于对照组,血液标本中COX-2的蛋白表达无显著的统计学意义(P>0.05)。骨肉瘤Ⅲ期组血液标本中COX-2的蛋白表达高于骨肉瘤Ⅰ期组和骨肉瘤Ⅱ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)：骨肉瘤Ⅱ期组血液标本中的COX-2的蛋白表达高于骨肉瘤Ⅰ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)。骨肉瘤组织标本中,采用qRT-PCR检测的miR-143的相对表达量分别是：骨肉瘤Ⅰ期0.71±0.04,骨肉瘤Ⅱ期0.26±0.05,骨肉瘤Ⅲ期0.11±0.04。三期骨肉瘤组分别相对于对照组,肿瘤组织标本中miR-143表达均显著下调(P<0.05)。骨肉瘤Ⅲ期组肿瘤组织标本中miR-143表达低于骨肉瘤Ⅰ期组和骨肉瘤Ⅱ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)；骨肉瘤Ⅱ期组肿瘤组织标本的miR-143表达低于骨肉瘤Ⅰ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)。骨肉瘤血液标本中,采用qRT-PCR检测的miR-143的相对表达量分别是：骨肉瘤Ⅰ期0.86±0.08,骨肉瘤Ⅱ期0.69±0.10,骨肉瘤Ⅲ期0.22±0.07。三期骨肉瘤组分别相对于对照组,血液标本中miR-143表达均显著下调(P<0.05)。骨肉瘤Ⅲ期组血液标本中miR-143表达低于骨肉瘤Ⅰ期组和骨肉瘤Ⅱ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)；骨肉瘤Ⅱ期组血液标本中的miR-143表达低于骨肉瘤Ⅰ期组,差异有显著的统计学意义(P<0.05)。结论在本研究中,明显的观察到伴随着骨肉瘤恶性程度的增加,COx-2因子的mRNA和蛋白在肿瘤组织中的表达逐步增多,组与组之间的差异都有显著的统计学意义(P<0.05),这是与前人的研究相吻合的,说明COX-2因子的表达变化是和骨肉瘤发生发展相关的。肿瘤转移的方式共分为三种：相邻器官浸润转移、种植转移和远处转移。由于肺部和脑部的血流量非常丰富,所以肺部和脑部常常成为骨肉瘤细胞以进入血液方式而进行的远处转移目标,其严重后果就是导致肺部肿瘤和脑部肿瘤。理论上讲,肿瘤远处转移依靠血液或组织液的方式决定了血液中检测到的COX-2因子亦可以间接反映骨肉瘤细胞的恶性程度和转移情况。在本研究中,能明显的观察到在血液标本中按骨肉瘤Ⅰ期组、骨肉瘤Ⅱ期组、骨肉瘤Ⅲ期组的顺序,COX-2因子的mRNA和蛋白表达都依次上调,而对照组和骨肉瘤Ⅰ期组血液标本中的COX-2因子的mRNA和蛋白表达无显著性差异(P>0.05)。这个结果与肿瘤组织中的COX-2因子的mRNA和蛋白表达趋势结果相比略有不同,其原因可能是骨肉瘤Ⅰ期虽然已经形成了骨肉瘤,但是肿瘤细胞还处于低度恶性阶段,未生长到能大量随血液转移的规模或是少量的肿瘤细胞在转移过程中被血液中的吞噬因子所吞噬和破坏。故血液标本中COX-2因子的mRNA和蛋白表达可能只能在一定程度上预测和观察肿瘤的转移情况,尤其是针对骨肉瘤Ⅰ期的时候这种预测能力并不明显。mRNA表达向上或向下调控受到很多因素的影响,mRNA的表达变化,又会影响到蛋白的表达直至影响机体功能。COX-2的mRNA是本研究中miR-143的靶mRNA之一,miR-143通过对mRNA进行切割并抑制其翻译发挥对它的靶目标COX-2的mRNA调控作用。由于miR-143稳定性的基因表达谱和特异性,使其早已成为很多与COX-2相关的疾病早期诊断和治疗的特异性生物标志物。本研究结果显示,按对照组、骨肉瘤Ⅰ期组、骨肉瘤Ⅱ期组、骨肉瘤Ⅲ期组的顺序,随着骨肉瘤患者肿瘤组织中的COX-2表达上调,血液标本和肿瘤组织标本中的miR-143表达依次下调,说明COX-2表达上调与miR-143的表达抑制有关。反而言之,正是因为有miR-143对COX-2的负向调控作用,miR-143很有可能以自身上调抑制COX-2表达的方式影响到慢性炎症产生,最终影响到肿瘤过程。血液标本中的miR-143的表达趋势,是与肿瘤组织中的COX-2的表达趋势相对应的。与血液标本中的COX-2表达大多数时候只能在骨肉瘤Ⅱ期、骨肉瘤Ⅲ期相对准确的反映骨肉瘤转移情况不同,血液标本中的miR-143却可以在骨肉瘤Ⅰ期就被观察到下调。miR-143和COX-2二者表达趋势并不完全对应的原因很有可能是因为别的调控通路影响了COX-2表达。因此,血液中miR-143的这种区别于血液中COX-2的敏感特点,有可能用于预测和预防骨肉瘤转移。