Endophilin-Ⅰ通过EGFR-JNK信号通路调节血脑屏障通透性的分子机制研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:w313829237
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的:  血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)主要由脑微血管内皮细胞和相邻细胞间的紧密连接构成,可以动态调节物质在血液循环和脑组织的交换,保持脑组织内环境的稳态,同时也限制了药物进入中枢神经系统。药物通过血肿瘤屏障进入脑组织主要有两条途径:细胞旁途径和跨细胞途径[1]。细胞旁途径的开放是指血管内皮细胞间的紧密连接开放。相关研究[2~4]证实,紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin的表达下调能使紧密连接开放,进而通过细胞旁途径增加血脑屏障通透性。  Endophilin-Ⅰ与Endophilin-Ⅱ、Endophilin-Ⅲ组成了一个家族,该家族的主要功能与神经递质的内吞有关,所以也称为内吞蛋白(endophilin)。Endophilin-Ⅰ是一种多功能蛋白,主要分布于中枢神经系统的细胞膜和细胞质中,其功能研究主要集中在调节细胞内吞和细胞内信号转导通路上[5,6]。Ung等[7~9]的研究证明,Endophilin-Ⅰ能够与Cbl蛋白和CIN85(Cbl-interactingproteinof85kDa)蛋白形成复合物,并与细胞膜上的表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)结合,促进EGFR的降解,抑制EGF介导的细胞内信号转导。  丝裂原激活蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)信号通路主要包括ERK,JNK和p38MAPK途径。有研究[10]表明,EGF能够激活MAPK通路的ERK途径,增加磷酸化的MEK1/2和ERK1/2;活化的ERK通路能够调节紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin的重分布,并抑制肌动蛋白细胞骨架的裂解,从而通过细胞旁途径降低血脑屏障的通透性。那么Endophilin-Ⅰ能否通过作用于EGFR而抑制MAPK通路的其它途径,进而通过细胞旁途径开放血脑屏障,目前未见相关报道。  本研究通过建立Endophilin-Ⅰ过表达和沉默的hCMEC/D3细胞系,研究EGFR-JNK信号通路在上述细胞系中的激活情况;应用JNK抑制剂SP600125作用于Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3,进一步研究EGFR-JNK信号通路是否参与了Endophilin-Ⅰ调节紧密连接相关蛋白的表达和重分布,明确其在血脑屏障细胞旁途径开放中的作用和分子机制。  方法:  1、构建Endophilin-Ⅰ重组质粒过表达载体,应用Endophilin-Ⅰ过表达载体和沉默载体分别转染hCMEC/D3,建立Endophilin-Ⅰ过表达和沉默的hCMEC/D3稳转细胞系。  2、实验分组  (1)、对照组1:对照组(control)  (2)、对照组2:Endophilin-Ⅰ过表达阴性对照组(pEGFR-contol)  (3)、对照组3:Endophilin-Ⅰ沉默阴性对照组(shRNA-contol)  (4)、实验组1:Endophilin-Ⅰ过表达组(pEGFR-Endo)  (5)、实验组2:Endophilin-Ⅰ沉默组(shRNA-Endo)  (6)、实验组3:Endophilin-Ⅰ沉默+SP600125组(shRNA-Endo+SP600125)  3、应用Westernblot法验证Endophilin-Ⅰ过表达和沉默效率。  4、应用Millicell-ERS电阻测量系统检测Endophilin-Ⅰ过表达和沉默对血脑屏障通透性的影响。  5、应用免疫荧光法检测Endophilin-Ⅰ过表达和沉默的hCMEC/D3细胞中EGFR、p-JNK的分布和表达。  6、应用Westernblot法检测Endophilin-Ⅰ过表达和沉默的hCMEC/D3细胞中EGFR、p-JNK的蛋白表达水平。  7、应用Millicell-ERS电阻测量系统检测SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默组血脑屏障通透性的变化。  8、应用透射电镜观察SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞紧密连接超微结构的改变。  9、应用免疫荧光法检测SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin的分布和表达变化。  10、应用Westernblot法检测SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞ZO-1、occludin的蛋白表达水平变化。  11、实验数据以均数±标准差((X)±SD)表示,采用SPSS19.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。  结果:  1、成功构建了Endophilin-Ⅰ重组质粒过表达载体,建立了Endophilin-Ⅰ过表达和沉默的hCMEC/D3稳转细胞系。  2、Endophilin-Ⅰ过表达,TEER值减小,血脑屏障的通透性增高;Endophilin-Ⅰ沉默,TEER值增大,血脑屏障的通透性降低。  3、在hCMEC/D3细胞中,EGFR分布于细胞膜和细胞质中,p-JNK主要分布于细胞质中。Endophilin-Ⅰ过表达的hCMEC/D3中EGFR、p-JNK的表达水平降低;Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3中EGFR、p-JNK的表达水平升高。  4、Endophilin-Ⅰ沉默,TEER值增大,血脑屏障的通透性降低;SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默组TEER值减小,血脑屏障的通透性增高。  5、透射电镜观察Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞紧密连接致密,电子致密度高;SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞紧密连接开放,间隙增宽。  6、Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin的表达水平升高,在细胞膜上呈连续线性分布;SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞ZO-1、occludin的表达水平降低,在细胞膜上呈不连续分布。  结论:  Endophilin-Ⅰ通过EGFR-JNK信号通路调节紧密连接,影响血脑屏障通透性。
其他文献
情境创设要提供与学生学习的基本内容相关的及与现实生活相类似的或真实的情境,使学生具有为理解主题解决问题所需要的经验,帮助学习者在这种情境中去发现、探索与解决问题.
讨论了在线反汇编。即使用探头直接获取CPU信息进行反汇编,以得到运行程序的汇编代码。并以8086CPU为例,叙述了使用逻辑分析卡实现在线反汇编的硬件原理与软件设计。 Discuss online dis
本文首先分析了浸没熔炼生产工艺流程特点及其对控制系统的要求。提出了对该过程进行控制的专家智能控制方案,重点论述了基于产生式规则的知识模型与解析的数学模型相结合的专
摘 要 辽宁省职教集团的构建将强有力地促进互动式的产学研结合,然而,职教集团的合作剩余与利益冲突问题也日益凸现。鉴于此,笔者借助合作博弈的相关研究方法,系统地提出了辽宁省职教集团利益诉求方的合作博弈策略,具体包括职教集团利益诉求的默契合作博弈与明确合作博弈。  关键词 辽宁省 职教集团 利益诉求 合作博弈  中图分类号:G710 文献标识码:A  0 引言  《国务院关于大力发展职业教育的决定》中
一、导言甜菜是世界两大糖料作物之一。块根是制糖的原料,一般可以提炼出13~15%的白糖。甜菜茎叶、制糖后的废丝、废蜜,不但是家畜的良好饲料,还可以作化工原料,制造糠醛、人
台大档案馆网站建设目标定位于档案的文化性,设计的功能重在档案信息资源与开发成果的宣传推广,设计的内容趣味性强,设计的语言多样化,既能满足不同语种用户的需要,也能吸引
摘 要 加强高校科协组织建设是贯彻落实十八大精神的客观需要,对于建设创新型国家、实现美丽中国梦具有重要意义。本文在分析当前高校科协发展存在问题的基础上,提出了加强高校科协组织建设的对策建议。  关键词 高校 科协 组织建设  中图分类号:G644 文献标识码:A  党的十八大报告明确提出要实施创新驱动发展战略,强调科技创新是提高社会生产力和综合国力的战略支撑,必须摆在国家发展全局的核心位置。高校是
2012年4月23日的《文萃报》摘发了一篇文章《单田芳:我曾犯过的单相思》,文中写道:“上学、放学她都是鹤立独行,回家就往屋里一待。”这里“鹤立独行”有问题。根据上下文,我
对学生进行学法指导,是数学教学方法改革的需要,是培养学生学习能力的需要,是更好地体现学生为主体的需要。  一、培养学生的质疑习惯  数学天才高斯说:“如果其他人也像我一样不迷信权威,持久而深入地探索数学真理,那么,他们也将做出我所做的发现。”华罗庚的成名作《苏家驹之代数的五次方程的解法不能成立的理由》纠正了苏教授的错误,而当时他只是一个初中毕业生。  如果一个学生墨守成规,不敢或不愿向教师、书籍提
摘 要:供水机泵设备的维修管理工作需要落实机械自身功能框架和元件数据,这样才能够确保整体维修管理工作具备细致钻研和分析的条件,同时在此基础上提供更加完善的管理条件,为后续设备功能的使用和质量鉴别工作提供更好的运行方案,以便自来水厂经济发展满足现有城市可持续化延伸的需求。本文基于供水机泵设备的维护管理必要性展开分析,确定实际存在的问题和有效的解决方法同时,期望为后续供水机泵体系的构建提供良好参照。