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目的： 血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)主要由脑微血管内皮细胞和相邻细胞间的紧密连接构成，可以动态调节物质在血液循环和脑组织的交换，保持脑组织内环境的稳态，同时也限制了药物进入中枢神经系统。药物通过血肿瘤屏障进入脑组织主要有两条途径:细胞旁途径和跨细胞途径[1]。细胞旁途径的开放是指血管内皮细胞间的紧密连接开放。相关研究[2～4]证实，紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin的表达下调能使紧密连接开放，进而通过细胞旁途径增加血脑屏障通透性。 Endophilin-Ⅰ与Endophilin-Ⅱ、Endophilin-Ⅲ组成了一个家族，该家族的主要功能与神经递质的内吞有关，所以也称为内吞蛋白(endophilin)。Endophilin-Ⅰ是一种多功能蛋白，主要分布于中枢神经系统的细胞膜和细胞质中，其功能研究主要集中在调节细胞内吞和细胞内信号转导通路上[5,6]。Ung等[7～9]的研究证明，Endophilin-Ⅰ能够与Cbl蛋白和CIN85(Cbl-interactingproteinof85kDa)蛋白形成复合物，并与细胞膜上的表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)结合，促进EGFR的降解，抑制EGF介导的细胞内信号转导。 丝裂原激活蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)信号通路主要包括ERK，JNK和p38MAPK途径。有研究[10]表明，EGF能够激活MAPK通路的ERK途径，增加磷酸化的MEK1/2和ERK1/2;活化的ERK通路能够调节紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin的重分布，并抑制肌动蛋白细胞骨架的裂解，从而通过细胞旁途径降低血脑屏障的通透性。那么Endophilin-Ⅰ能否通过作用于EGFR而抑制MAPK通路的其它途径，进而通过细胞旁途径开放血脑屏障，目前未见相关报道。 本研究通过建立Endophilin-Ⅰ过表达和沉默的hCMEC/D3细胞系，研究EGFR-JNK信号通路在上述细胞系中的激活情况;应用JNK抑制剂SP600125作用于Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3，进一步研究EGFR-JNK信号通路是否参与了Endophilin-Ⅰ调节紧密连接相关蛋白的表达和重分布，明确其在血脑屏障细胞旁途径开放中的作用和分子机制。 方法： 1、构建Endophilin-Ⅰ重组质粒过表达载体，应用Endophilin-Ⅰ过表达载体和沉默载体分别转染hCMEC/D3，建立Endophilin-Ⅰ过表达和沉默的hCMEC/D3稳转细胞系。 2、实验分组 (1)、对照组1:对照组（control） (2)、对照组2:Endophilin-Ⅰ过表达阴性对照组(pEGFR-contol) (3)、对照组3:Endophilin-Ⅰ沉默阴性对照组(shRNA-contol) (4)、实验组1:Endophilin-Ⅰ过表达组(pEGFR-Endo) (5)、实验组2:Endophilin-Ⅰ沉默组（shRNA-Endo） (6)、实验组3:Endophilin-Ⅰ沉默+SP600125组（shRNA-Endo+SP600125） 3、应用Westernblot法验证Endophilin-Ⅰ过表达和沉默效率。 4、应用Millicell-ERS电阻测量系统检测Endophilin-Ⅰ过表达和沉默对血脑屏障通透性的影响。 5、应用免疫荧光法检测Endophilin-Ⅰ过表达和沉默的hCMEC/D3细胞中EGFR、p-JNK的分布和表达。 6、应用Westernblot法检测Endophilin-Ⅰ过表达和沉默的hCMEC/D3细胞中EGFR、p-JNK的蛋白表达水平。 7、应用Millicell-ERS电阻测量系统检测SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默组血脑屏障通透性的变化。 8、应用透射电镜观察SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞紧密连接超微结构的改变。 9、应用免疫荧光法检测SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin的分布和表达变化。 10、应用Westernblot法检测SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞ZO-1、occludin的蛋白表达水平变化。 11、实验数据以均数±标准差((X)±SD)表示，采用SPSS19.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 1、成功构建了Endophilin-Ⅰ重组质粒过表达载体，建立了Endophilin-Ⅰ过表达和沉默的hCMEC/D3稳转细胞系。 2、Endophilin-Ⅰ过表达，TEER值减小，血脑屏障的通透性增高;Endophilin-Ⅰ沉默，TEER值增大，血脑屏障的通透性降低。 3、在hCMEC/D3细胞中，EGFR分布于细胞膜和细胞质中，p-JNK主要分布于细胞质中。Endophilin-Ⅰ过表达的hCMEC/D3中EGFR、p-JNK的表达水平降低;Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3中EGFR、p-JNK的表达水平升高。 4、Endophilin-Ⅰ沉默，TEER值增大，血脑屏障的通透性降低;SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默组TEER值减小，血脑屏障的通透性增高。 5、透射电镜观察Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞紧密连接致密，电子致密度高;SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞紧密连接开放，间隙增宽。 6、Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin的表达水平升高，在细胞膜上呈连续线性分布;SP600125作用后Endophilin-Ⅰ沉默的hCMEC/D3细胞ZO-1、occludin的表达水平降低，在细胞膜上呈不连续分布。 结论： Endophilin-Ⅰ通过EGFR-JNK信号通路调节紧密连接，影响血脑屏障通透性。