论文部分内容阅读
骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种慢性退行性关节疾病，致残率高，危害大，发病机制目前尚不完全明确，没有特效的早期预防及治疗方法。最新的研究表明：WISP-1(Wnt-induced signaling protein-1,WISP-1)作为一个Wnt信号通路中的下游调控因子，在动物试验中证实与OA的发病机制有关，并具有很高的特异性，是理想的治疗靶点。本研究采用人骨关节炎滑膜细胞，使用RNAi（RNA interference，RNAi）技术，特异性的抑制细胞内WISP-1的表达，从而达到治疗OA的目的。三嵌段温敏性聚合物（Poly(D, Lactic acid-co-glycol acid)-b-poly[ethylene glycol]-b-Poly(D, Lactic acid-co-glycol acid)，PLGA-PEG-PLGA）是一种性质优良的基因缓释载体，装载shRNA质粒DNA后，在体温下保持长时间稳定降解及释放，同时加入新型阳离子聚合物转染剂：星型聚谷氨酸苄酯聚合物（multi-armed poly(L-glutamic acid)-graft-oligoethylenimine，MP-g-OEI），增加转染效率。将上述复合物作用于骨关节炎滑膜细胞，进行RNA干涉，观察疗效。从而证实WISP-1在骨关节炎发病机制中的作用，以及温敏性水凝胶复合物缓释基因的能力。为OA治疗开辟新道路。根据以上思路，首先制备三嵌段温敏性聚合物PLGA-PEG-PLGA。以乙交酯、丙交酯和聚乙二醇（1000）为单体，在辛酸亚锡催化下，通过开环聚合方法合成了三嵌段PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶，并对该聚合物进行了全面、详细表征。三嵌段PLGA-PEG-PLGA聚合物在低温时可完全溶于水，而随着温度逐渐升高，PLGA-PEG-PLGA聚合物由于PLGA链的疏水作用而形成胶束。越来越多的胶束聚集通过PLGA链段间的疏水作用而完成凝胶转变。当温度继续升高时，PEG链段发生脱水作用，胶束间的疏水作用不断增强，导致体系发生凝胶-沉淀。通过动态流变学和试管导致法研究PLGA-PEG-PLGA聚合物溶液的凝胶转变过程。PLGA-PEG-PLGA具有适宜转变温度，在室温下呈液态，且粘度较小；体温时可转变为凝胶状态，局部稳定存在：适合作为可注射型植入生物材料。体内外PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶降解实验表明水凝胶具有良好的可降解性。体外降解需要6周以上，而体内5周可完全降解。体内降解加快，可能与体内环境有关，例如激活免疫应答，炎性因子、细胞增多有关。并且对周围组织无任何损伤，具有良好生物组织相容性。细胞毒性表明该聚合物具有良好细胞相容性。然后进行温敏性可降解水凝胶PLGA-PEG-PLGA缓释WISP-1基因的RNAi技术在骨关节炎中的治疗作用的研究。首先研究PLGA-PEG-PLGA水凝胶包载质粒DNA的释放。此释放过程可分为3个阶段。第1个阶段：12小时早期爆发式释放；第二个阶段：持续释放期（12小时-3天）；第三个阶段：释放平台期（3天以后）。质粒DNA释放机制，主要包括两种情况：早期爆发式释放，主要通过液体的弥散作用，另外随着水凝胶的降解出现释放的平台期。然后将三嵌段温敏性聚合物PLGA-PEG-PLGA携带MP-g-OEI/WISP-1-shRNA质粒，在体温下保持长时间稳定释放。将上述复合体在作用于人骨关节炎滑膜细胞，进行RNA干涉，观察疗效。结果发现无水凝胶对照组和实验组WISP-1表达量均逐步明显减少。并且随着时间的推移，实验组表现出良好的缓释作用，RNAi的效果明显高于对照组。另外，在抑制WISP-1基因的表达同时，还发现Wnt信号通路下游的MMP-3和AMADTS-4基因表达的降低，因此能够减少这些炎性因子对软骨细胞外基质的破坏，也进一步证实了WISP-1参与Wnt信号通路，说明了WISP-1的抑制有治疗OA的潜力。