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研究背景： 肺癌是我国第一大癌症，寻找新的高效低毒抗肺癌药物具有重大意义。天然生物碱是抗肿瘤药物的重要来源，本课题前期针对天然生物碱进行了大量的筛选工作，发现毛钩藤碱(Hirsutine)具有良好的体内外抗肺癌活性，对正常细胞毒性小，具有开发成为高效低毒的抗肺癌新药潜力。毛钩藤碱(Hirsutine)是茜草科藤本植物钩藤（Uncaria rhynchophylla）中的生物碱类活性成分之一，已有报道，Hirsutine具有保护缺氧诱导的心肌损伤，保护炎症介导的神经损伤的作用，在抗肿瘤领域亦有报道，Hirsutine可抑制乳腺癌细胞的转移和侵袭，诱导乳腺癌细胞DNA损伤，提示Hirsutine具有抗肿瘤活性。但 Hirsutine 抗肺癌作用及分子机制尚不明确。因此，本课题拟进一步明确Hirsutine是否具有选择性抗肺癌作用，并阐明其具体作用机制。 一、Hirsutine选择性诱导肺癌细胞凋亡 CCK8法和流式细胞术检测发现Hirsutine可诱导肺癌A549和NCI-H1299细胞凋亡增加，呈现良好的量效和时效关系，Western blot检测发现Hirsutine可诱导凋亡相关蛋白C-PARP和C-Caspase 3表达增加。但Hirsutine对人正常肝细胞LO2、人正常胚肺细胞WI-38几乎没有毒性。提示Hirsutine可能具有高效、低毒的抗肺癌效应。 二、Hirsutine诱导肺癌细胞线粒体损伤 电镜观察到Hirsutine作用后线粒体呈现空泡化、肿胀和内嵴紊乱，提示Hirsutine可能诱导了线粒体损伤。JC-1染色显示Hirsutine可显著下调线粒体膜电位且具有良好量效关系。荧光素酶法 ATP 检测试剂盒检测到 Hirsutine 可显著下调 ATP 的产生。DCFH-DA染色法流式检测发现Hirsutine可诱导细胞ROS产生增加。Western blot检测Cyto C从线粒体释放到胞浆增加。Calcein-AM/CoCl2染色法发现Hirsutine可诱导线粒体渗透性转换孔（MPTP）开放，免疫沉淀和MPTP开放抑制剂Cyclosporin A的应用确认Hirsutine诱导了环亲和素D（cyclophilinD, CypD）和腺苷酸转运体（adenine nucleotide translocase 1, ANT1）直接结合，从而促使MPTP孔开放，导致线粒体损伤途径细胞凋亡。 三、Hirsutine通过ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β通路诱导肺癌细胞凋亡 1、为了进一步阐明Hirsutine诱导肺癌细胞线粒体损伤的机制，采用Western blot法检测到 Hirsutine 诱导 GSK3β（S9）去磷酸化，呈现良好的量效和时效关系。应用GSK3β（S9）小分子抑制剂 CHIR99021 进一步确认 Hirsutine 诱导的 CypD 和 ANT1结合介导的MPTP开放依赖于GSK3β（S9）去磷酸化。 2、由于GSK3β（S9）是PI3K/Akt通路重要的下游靶点，采用Western Blot法检测PI3K、Akt蛋白表达情况，发现Hirsutine可显著去磷酸化抑制PI3K/Akt活性，并呈现良好的量效和时效关系。采用PI3K抑制剂LY294002发现LY294002可进一步加剧Hirsutine诱导的GSK3β（S9）去磷酸化；LY294002可进一步降低Hirsutine诱导的p-GSK3β（S9）与ANT1直接结合，增加ANT1和CypD结合介导的MPTP开放，增加细胞凋亡。 3、进一步研究发现，Hirsutine可诱导ROCK1降解激活、PTEN磷酸化，采用ROCK1抑制剂Y-27632和慢病毒基因敲降ROCK1均可阻断Hirsutine诱导的PTEN磷酸化、PI3K/Akt/GSK3β 去磷酸化；Y-27632 或稳定敲降 ROCK1 均可逆转 Hirsutine 诱导的p-GSK3β（S9）与 ANT1 结合降低；Y-27632 或稳定敲降 ROCK1 均可阻断 Hirsutine诱导的CypD与ANT1直接结合，并进一步阻断MPTP开放，逆转ATP产生减少和细胞凋亡。表明Hirsutine诱导的PI3K/Akt抑制和MPTP开放依赖于ROCK1/PTEN途径的激活。 四、肺癌裸鼠异种移植瘤模型证实 Hirsutine 具有良好的抗肺癌作用，并通过激活了ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β通路 1、采用肺癌A549细胞株构建裸鼠移植瘤模型。随机将裸鼠分为Hirsutine处理组和无菌盐水对照组，定期测量裸鼠生长体重和瘤体体积，每日观察裸鼠状态。结果发现，与对照组相比，Hirsutine可显著抑制裸鼠移植瘤的生长，两组体重无显著差异，肝肾HE染色结果提示Hirsutine对裸鼠无明显肝肾毒性，提示Hirsutine在一定剂量和作用时间下具有高效低毒的体内抗肺癌效应。 2、为验证ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路在Hirsutine诱导的体内抗肺癌效应中的重要作用，采用免疫组化法和Western blot法检测了ROCK1、P-PTEN、P-PI3K、p-Akt及p-GSK3β（S9）的表达，免疫组化染色发现：Hirsutine处理组C-Caspase 3表达增加，p-GSK3β（S9）减少。Western blot检测发现：Hirsutine处理可降解激活移植瘤中ROCK1，增加PTEN磷酸化，降低p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β（S9）的表达。表明Hirsutine体内水平诱导的A549细胞凋亡通过激活ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路。 本文主要结论如下：Hirsutine可选择性诱导多种肺癌细胞凋亡，并可有效抑制肺癌裸鼠移植瘤生长，具有较强的体内外抗肺癌效应。机制研究发现Hirsutine的抗肺癌作用依赖于ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路的激活，进而引起MPTP开放介导的线粒体损伤，最终导致Caspase激活和细胞凋亡。本研究明确了Hirsutine的体内外抗肺癌作用，阐明了Hirsutine抗肺癌的具体分子机制，为开发Hirsutine成为高效低毒的抗肺癌药物和ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路分子成为新的肿瘤治疗靶点提供实验依据。