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来源于指孢囊菌的脯氨酸4-羟化酶，可直接在游离的L-脯氨酸的第4位上加羟基，生成反式-4-羟脯氨酸。为了使脯氨酸4-羟化酶基因在大肠杆菌中得到高表达并实现L-脯氨酸高效转化，根据大肠杆菌密码子偏好性，重新设计合成了脯氨酸4-羟化酶基因。经密码子优化后的脯氨酸4-羟化酶基因与初始基因序列比较，脯氨酸4-羟化酶基因密码子适用指数CAI从初始的0.3992调整为0.9941，接近于最优值1，且GC百分比含量降低至59.34%。利用软件预测初步优化的脯氨酸4-羟化酶基因mRNA二级结构和mRNA折叠能ΔG，通过改变同义密码子调整脯氨酸4-羟化酶基因的mRNA的5’端结构，使得脯氨酸4-羟化酶基因的mRNA的5’端呈开放式，确保mRNA的翻译效率，使脯氨酸4-羟化酶基因序列得到进一步优化。最终139个碱基通过同义密码子被替换，同时，GC百分比从73.62%降低至59.27%。选择色氨酸串联启动子控制脯氨酸4-羟化酶的表达，经优化后的脯氨酸4-羟化酶基因序列和色氨酸串联启动子经全基因合成后，连接到pAMP质粒上，构建重组质粒pAMP-ptrp2-Hyp。为了提高脯氨酸4-羟化酶的表达量和反式-4-羟脯氨酸产率，通过摇瓶实验优化宿主菌和质粒后，最终选择重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp作为脯氨酸4-羟化酶的表达菌株，重组菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp的脯氨酸4-羟化酶全细胞活性达到0.075±0.004U/mg。在摇瓶发酵过程中，重组大肠杆菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp表达的脯氨酸4-羟化酶将发酵液中的L-脯氨酸转化为反式-4-羟脯氨酸。为了使反式-4-羟脯氨酸得到高产，通过单因素分析和正交试验分析，得到了摇瓶发酵的最优条件是：葡萄糖10g/L，甘油5g/L，胰蛋白胨8g/L，硫酸铵5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸亚铁3mM。最终摇瓶发酵中反式-4-羟脯氨酸产量高达1396±21mg/L，比未优化前的370mg/L提高了2.77倍。在发罐水平，合适的补料策略对反式-4-羟脯氨酸的生产至关重要。利用补料分批发酵来提高反式-4-羟脯氨酸的产量，并对间歇流加补料和匀速流加补料方式进行了比较，结果发现当匀速补糖速度为18g/h时，反式-4-羟脯氨酸的产量高达42.5g/L，反式-4-羟脯氨酸生产速率可达到0.966g/(L·h)。由于脯氨酸4-羟化酶的催化需消耗大量的氧气，影响细胞生长代谢，导致重组菌发酵时溶氧过低。为了解决溶氧过低的问题，通过在分子水平上引入透明颤菌血红蛋白基因，构建一株含VHb的重组菌，利用CO差异光谱法分析血红蛋白活性，发现重组菌表达的VHb在419nm处有波峰，在436nm处有波谷。在摇瓶发酵中，含有VHb的重组菌在发酵培养64h后产酸量高达6.19±0.28g/L，是对照组的2.57倍，同时，菌体OD600达到9.26±0.42，较对照组提高了56%。