恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和弓形虫（Toxoplasma gondii）是顶复门原虫的两个代表虫种，是专性细胞内寄生虫，可以感染真核生物的多种宿主细胞。疟原虫裂殖子在血细胞期主要侵入宿主的红细胞，并在红细胞内发育繁殖。感染恶性疟原虫的红细胞可以与宿主毛细血管的内皮细胞粘附，进而逃避脾脏的清除。而弓形虫可以侵入任何有核细胞，但两种虫体入侵宿主细胞的分子机制尚不完全清楚。研究发现，顶复门寄生虫侵入宿主细胞是一个连续的过程，侵入的必要条件是虫体的多种分子（配体）与宿主细胞表面受体粘附。肝素类糖胺聚糖分子是虫体侵入细胞的主要受体，肝素类分子能够抑制虫体对细胞的侵入功能，但是与该类受体相互作用的关键分子及其作用机制目前还不清楚。而对这些分子的阐明不但可以解释疟原虫、弓形虫的分子致病机理，还有利于寻找阻断虫体在宿主体内繁殖的药物靶标和疫苗候选抗原。迄今为止，在疟原虫和弓形虫中确定的与肝素结合的蛋白质非常有限。早期研究结果表明，肝素能够抑制恶性疟原虫侵入宿主红细胞，并认为肝素通过与裂殖子表面蛋白质MSP1相互作用，进而阻断了裂殖子与红细胞表面的粘附。而目前发现的与肝素结合的刚地弓形虫蛋白质有5个，他们分别是棒状体蛋白质ROP2和ROP4，致密颗粒蛋白GRA2，表面蛋白质SAG1和SAG3。但这些结果并不能完全解释肝素抑制虫体入侵的全部机理。在本研究中，我们提出了一种新的研究方法，即基于受体的亲和纯化，再结合高通量蛋白质质谱分析的方法，首次对恶性疟原虫和刚地弓形虫宿主细胞侵入相关的蛋白质组进行了全面和深入的研究，在鉴定了两种虫体与肝素结合的蛋白质组的基础上，比较两种虫体与肝素结合的蛋白质的功能特征。最终用大量的实验数据揭示了肝素抑制恶性疟原虫和刚地弓形虫侵入宿主细胞的作用机理。我们认为，肝素主要是通过与疟原虫、弓形虫表面及顶复合体中的棒状体分子结合，阻断这些细胞黏附分子与宿主细胞表面受体的作用，进而抑制虫体对宿主细胞的侵入。1.肝素类分子抑制虫体侵入的分析我们通过体外抑虫实验，将不同浓度的肝素类似物（包括肝素、硫化肝素和硫酸葡聚糖）加入虫体培养基中，比较这些分子对虫体侵入细胞的抑制能力。在我们的实验中，所有的样品都进行了三次重复实验，在每次重复实验中设有三个平行实验。结果显示：随着肝素、硫化肝素、硫酸葡聚糖浓度的增加，裂殖子的相对侵入率下降，抑制作用逐渐增强，而硫酸软骨素没有抑制作用。硫化肝素的抑制作用较弱，只有当其浓度达到1000μg/mL时，才有抑制作用，而低浓度时没有抑制作用。结果进一步证实了肝素类分子能够抑制虫体侵入。2.恶性疟原虫、弓形虫肝素结合蛋白质组的鉴定及比较分析本研究首先用人的红细胞培养恶性疟原虫3D7株，用昆明鼠培养弓形虫RH株速殖子，然后利用Percoll梯度离心的方法纯化疟原虫裂殖体和弓形虫速殖子。将纯化后的虫体悬浮于含有蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液中，反复冻融几次后高速离心。将含有虫体可溶性蛋白质的上清液与Heparin-sepharose混合，然后洗脱掉未结合的蛋白质，用SDS-PAGE和Western-Blot方法鉴定与肝素结合的蛋白质。结果显示：无论是疟原虫还是弓形虫，均有多种蛋白质与Heparin-sepharose结合。进一步实验结果表明，高浓度的肝素可以竞争性抑制虫体蛋白与Heparin-sepharose结合，而硫酸软骨素A完全没有抑制作用，且未偶联肝素的Sepharose与虫体蛋白不结合，由此说明这些蛋白质与肝素的结合具有特异性。为了鉴定与肝素结合的恶性疟原虫、弓形虫的蛋白质组，我们采用亲和层析的方法，首先纯化与Heparin-sepharose特异性结合的蛋白质，然后将蛋白质酶解成肽段，进行二维液相色谱与质谱串联分析。我们根据胰蛋白酶的酶切规律，对混合数据库中的参考序列进行模拟酶切，与生成的质谱峰文件进行比对，鉴定出匹配的肽段。结果显示：我们总共鉴定到了6062个独有肽段，通过与疟原虫数据库比对，共鉴定出811个恶性疟原虫蛋白质。其中99%的多肽来源于恶性疟原虫3D7，仅有87个多肽与人和牛的蛋白质匹配。用同样的方法，我们从弓形虫的肝素结合蛋白质中鉴定到了6252个独有肽段，通过与NCBI数据库比对，共鉴定出956个弓形虫蛋白质和188个小鼠蛋白质。研究进一步说明，肝素可以与恶性疟原虫裂殖子和刚地弓形虫速殖子的多种蛋白质相互作用。我们将鉴定到的恶性疟原虫和弓形虫的蛋白质组按照分布部位和生物学功能进行分类。结果显示：蛋白质的亚细胞定位分布相当广泛，包括细胞质、细胞核、线粒体，以及棒状体、微线体等16类。通过GO分析和相关文献查询，可以进一步将这些肝素结合蛋白质分为14个生物学功能亚类，且恶性疟原虫和弓形虫的蛋白质组在相同的亚细胞定位和生物学功能分类中，数量相差不大，由此说明顶复门寄生虫可能具有相似的宿主细胞侵入机制。此外，还发现了很多功能未知的蛋白质，且弓形虫组显著高于恶性疟原虫组，这说明了多数弓形虫蛋白质的功能尚不清楚。在这些功能相关的蛋白质中与红细胞侵入相关的恶性疟原虫蛋白质有47个，与有核细胞侵入相关的弓形虫蛋白质有33个，其中多数为棒状体相关蛋白质。棒状体是顶复门寄生虫独有的细胞器，该细胞器分泌的一些蛋白质参与了虫体与宿主细胞间移动接头的形成。在裂殖子侵入宿主细胞的过程中，肝素通过与棒状体蛋白质相互作用，可能抑制了移动接头的组装，或者阻断了他们与宿主细胞膜受体的结合。更为重要的是，在这些肝素结合蛋白质中有170个蛋白质在疟原虫和弓形虫中呈现相同的亚细胞定位和生物学功能。由此说明两种虫体具有相似的细胞侵入机理。3.恶性疟原虫重组蛋白质的肝素抑制实验及体外抑虫实验我们将与肝素结合的16个蛋白质分别克隆到pGEX-4T-1或pET32a载体上，用重组蛋白质进一步验证肝素结合的特异性。结果显示：16个分子中有14个蛋白质片段成功地获得了可溶性表达，可以进行后续的肝素结合实验。其中，有9个蛋白质片段与Heparin-sepharose结合，5个蛋白质片段不与Heparin-sepharose结合，这说明了蛋白质与肝素的结合是特异的。最后，为了进一步验证这些蛋白质的功能，我们通过抑虫实验检测了恶性疟原虫四个重组蛋白质抑制虫体侵入的能力。结果显示：棒状体蛋白3-48，丝氨酸重复抗原5-50和裂殖子表面蛋白1-42均能抑制虫体侵入红细胞，而裂殖子表面蛋白1-33和谷胱甘肽-S-转移酶没有抑制作用。因此说明与肝素结合的裂殖子相关蛋白质在虫体侵入细胞过程中发挥了重要作用。综上所述，本研究通过受体亲和层析结合高通量蛋白质组学分析方法及一系列验证实验，发现了恶性疟原虫和刚地弓形虫与肝素相互作用的多种蛋白质分子，其中与侵入相关的分子主要分布在棒状体细胞器中。该研究结果不但确定了肝素类分子是疟原虫和弓形虫侵入宿主细胞的重要受体，还揭示了肝素抑制虫体侵入宿主细胞的作用机理，也进一步证实了肝素衍生物作为抗虫药物的可行性。