背景肝脏移植是目前治疗终末期肝病及急性肝功能衰竭的最有效的外科治疗手段，但是移植后的急性排斥反应仍然是导致移植物失功和影响受体术后长期生存的重要原因，因此寻找如何减轻急性排斥反应的方案是肝移植外科研究领域的焦点之一。课题组前期研究发现Kupffer细胞（KCs）作为机体最大的单核巨噬细胞群，在移植肝脏免疫耐受诱导过程中发挥着重要作用，其机制与调控Th1/Th2免疫平衡有关。新近发现microRNA-155（miR-155）参与了机体单核巨噬细胞的免疫调控，但目前相关研究尚未涉及器官移植领域。因此，探索KCs中miR-155活性在移植肝脏免疫调控中的作用及机制，可能为临床肝脏移植术后诱导特异免疫耐受提供新的思路和理论依据。第一部分microRNA-155对KCs细胞功能、SOCS1/JAK/STAT炎症信号通路影响的实验研究目的：分离、培养小鼠KCs，转染miR-155模拟物及其抑制剂，观察过表达或抑制miR-155对活化KCs抗原呈递功能、SOCS1/JAK/STAT炎症信号通路及其对T细胞增殖、凋亡的影响和相关机制。方法:采用胶原酶消化联合密度梯度离心法分离KCs，CD68免疫染色鉴定分离所得KCs，台盼蓝拒染及吞墨实验判断KCs的活力及功能，并观察KCs形态变化。将分离、培养好的KCs随机分为4组：①miR-155抑制剂组（100nmol/L，miR-155inhibitor）；②miR-155抑制剂对照组（100nmol/L，control inhibitor）；③miR-155模拟物组（100nmol/L，miR-155mimic）；④miR-155模拟物对照组（100nmol/L，control mimic）。荧光显微镜鉴定转染效果，Real Time-PCR检测各组KCs中miR-155及SOCS1的mRNA表达水平，Western Blot检测KCs中FasL、SOCS1、JAK2/STAT3及其磷酸化蛋白表达水平，流式细胞仪（FCM）检测KCs表面抗原递呈相关分子（MHC-II、CD86和CD40）表达变化，分离小鼠脾脏淋巴细胞，尼龙毛柱过滤纯化T细胞，FCM检测其纯度后，与上述KCs共培养，MTT法检测T细胞增殖情况，Annexin V/PI法FCM检测T细胞凋亡情况，ELISA测定上清液中IFN-γ、TNF-α及IL-10含量。结果：（1）吞墨实验见KCs吞噬大量碳素颗粒。台盼蓝染色显示各组细胞的活力均在90%以上。免疫组化染色可见CD68分子在细胞边缘强表达。转染miR-155抑制剂及模拟物后6h，在荧光显微镜下就可见部分KCs有荧光表达，但强度较弱，24h时转染效果明显，90%的KCs可见明显荧光表达，转染后第7d，仍可见大部分KCs有荧光分布，第14d逐渐减弱。Real-time PCR检测转染24h后各组KCs，发现miR-155mimic组中miR-155相对表达量是其对照组的210.67倍，而miR-155inhibitor组中miR-155相对表达量是其对照组的0.0029倍。FCM检测各组KCs表面分子MHCⅡ、CD86和CD40表达量，miR-155inhibitor组明显低于control inhibitor组，而miR-155mimic组却明显高于control mimic组（P<0.05）。Western Blot结果显示：抑制KCs miR-155活性可上调SOCS1表达，进而抑制其下游因子JAK2/STAT3的表达及其磷酸化水平，而增强KCs miR-155活性则可下调SOCS1表达，从而增强其下游因子JAK2/STAT3的表达及其磷酸化水平（P<0.05）。FCM检测T细胞纯度为75.42%，其中CD4+为52.63%，和各组KCs共培养3d后，发现抑制KCs miR-155活性后T细胞增殖受到明显抑制，凋亡明显增加，促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α）分泌减少，抗炎细胞因子（IL-10）分泌增加（P<0.05），其中T细胞凋亡增加机制与可能KCs上调FasL表达有关，而上调KCs miR-155活性后T细胞增殖则明显增强，凋亡明显减少，促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α）分泌增加，抗炎细胞因子（IL-10）分泌减少（P<0.05）。结论：（1）miR-155inhibitor和mimic能有效抑制和增强KCs中miR-155表达；抑制KCs中miR-155表达可下调其表面分子MHCⅡ，CD86和CD40的表达，减弱其抗原呈递功能，并影响SOCS1/JAK/STAT炎症通路，减少促炎细胞因子的分泌，还可抑制T淋巴细胞增殖，增加T淋巴细胞凋亡，其机制可能与KCs上调FasL表达有关；而增强KCs中miR-155表达则可上调其表面分子MHCⅡ，CD86和CD40的表达，增强其抗原呈递功能，并增加促炎细胞因子的分泌，还可增强T淋巴细胞增殖，抑制T淋巴细胞凋亡。第二部分小鼠原位肝移植模型和Kupffer细胞RNA干扰动物模型的建立目的：建立BALB/c-C3H小鼠原位肝移植模型，用携带miR-155短发夹RNA（miR-155-shRNA）的慢病毒经门静脉注射导入供体肝脏，探讨该途径在小鼠原位肝移植动物模型中实现KCs RNA干扰的有效性；方法:采用“Kamada”两袖套法建立BALB/c-C3H小鼠原位肝移植模型，随机分为3组：①生理盐水组（NS）：经门静脉注射0.2mL NS；②对照组（Control）：经门静脉注射0.2mL浓度为1×109Tu/mL阴性对照慢病毒；③转染组（miR-155-shRNA）：经门静脉注射0.2mL浓度为1×109Tu/mL携miR-155-shRNA慢病毒。观察术中各步骤手术时间，Real-time PCR检测术后1d，4d，7d供肝及KCs中miR-155表达水平结果：采用“Kamada”两袖套法可建立稳定的BALB/c-C3H小鼠原位肝移植模型，三组各步骤手术时间之间无明显差异（P>0.05），Real-timePCR检测结果显示：术后1d，4d，7d，转染组miR-155在供肝及KCs中表达量明显低于NS组和对照组，且随时间推移逐渐降低（P<0.05）结论：采用“两袖套法”非动脉化的血管重建方法能成功建立BALB/c-C3H小鼠原位肝移植模型，而经门静脉高压注射向肝脏内导入miR-155-shRNA慢病毒，能实现供肝及KCs miR-155基因的有效沉默。第三部分抑制Kupffer细胞microRNA-155活性诱导小鼠原位肝移植免疫耐受的实验研究目的：研究沉默供肝KCs中miR-155活性后对小鼠肝移植急性排斥反应的影响及相关机制。方法:采用“Kamada”两袖套法建立BALB/c-C3H小鼠原位肝移植模型，随机分为：生理盐水组（NS）；对照组（Control）；转染组（miR-155-shRNA），方法和剂量同上。观察术后生存率及一般情况，于术后7d获取肝脏及血液标本，观察肝脏组织病理变化，TUNEL法检测肝组织凋亡情况，Real-time PCR和WesternBlot分别检测肝组织中SOCS1、IFN-γ、IL-10mRNA和蛋白表达水平，全自动生化分析法测定血清ALT和AST变化，ELISA检测血清IFN-γ和IL-10含量。结果：BALB/c-C3H小鼠原位肝移植模型术后7d天内可诱发典型的急性排斥反应，为急性排斥反应模型，NS组，对照组及转染组7d生存率分别为25.00%，16.67%和91.67%，经门静脉转染miR-155-shRNA慢病毒后，能明显改善肝脏组织病理学改变及肝功能变化，减轻急性排斥反应，延长小鼠生存时间，同时增加汇管区淋巴细胞凋亡，Real-time PCR、Western Blot和ELISA检测结果显示：转染组IFN-γ mRNA及蛋白表达量明显低于NS组和对照组（P<0.05）；而IL-10mRNA及蛋白表达量却明显高于NS组和对照组（P<0.05），其机制可能与抑制miR-155活性后，炎症负性调控因子SOCS1表达上调有关。结论：BALB/c-C3H小鼠原位肝移植模型为急性排斥反应模型，经门静脉转染miR-155-shRNA慢病毒抑制肝脏内及KCs中miR-155活性后，可明显改善移植肝脏病理及肝功能变化，延长小鼠生存时间，并通过上调Th2型典型细胞因子（IL-10）和下调Th1型典型细胞因子（IFN-γ）的基因和蛋白表达，从而实现Th1/Th2免疫偏移，有利于免疫耐受的诱导。