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第一部分 内源性线粒体解偶联蛋白在脑出血模型中抑制小胶质细胞介导的炎症应答目的:研究内源性解偶联蛋白在脑出血后小胶质细胞介导的神经炎症中的作用。方法:1)以红细胞裂解液(RBC lysate)处理BV2小胶质细胞系和原代小胶质细胞,以模拟小胶质细胞在脑出血后的激活。线粒体ROS是内源性解偶联蛋白的关键内源性激活剂。采用线粒体氧自由基(ROS)探针MitoSOX来观察线粒体ROS水平、并以MitoTracker Green和Hoechst分别标记线粒体和细胞核,以此探究在RBC lysate处理后,小胶质细胞是否产生线粒体ROS。2)研究RBC lysate能否激活内源性线粒体解偶联蛋白(uncoupling rotein,UCP)。UCP激活导致线粒体膜电位和胞内ATP水平下降。为表明RBC lysate能激活小胶质细胞UCP,采用线粒体膜电位荧光探针四甲基罗丹明乙酯(TMRM)检测小胶质细胞线粒体膜电位,并以ATP试剂盒检测胞内ADP/ATP水平,以探究RBC lysate能否降低小胶质细胞线粒体膜电位及胞内ATP水平。3)利用小干扰RNA(UCP2-siRNA)敲减小胶质细胞UCP2,以表明RBC lysate降低小胶质细胞线粒体膜电位的作用依赖于UCP2。4)BV2小胶质细胞敲减UCP2后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测敲减UCP2是否加剧RBC lysate导致的小胶质细胞炎症。5)利用慢病毒介导的茎环干扰RNA(UCP2-shRNA)技术敲减小鼠纹状体内UCP2,在胶原酶导致小鼠纹状体脑出血后,检测脑出血小鼠纹状体含水量,以及炎症因子IL-1 β、IL-6、TNF-α的水平,以在整体动物水平研究内源性UCP2对脑出血后炎症的影响。结果:1)通过MitoSOX红色荧光和共定位的MitoTracker绿色荧光显示,与对照组相比,BV2小胶质细胞和原代小胶质细胞在RBC lysate处理后6h-24h内线粒体ROS水平显著升高。2)RBC lysate可显著降低BV2小胶质细胞的线粒体膜电位及细胞内ATP水平。3)经UCP2-siRNA转染后BV2小胶质细胞UCP2的内源性表达显著降低,而且UCP2的敲减可以阻断RBC lysate降低小胶质细胞线粒体膜电位的作用。4)敲减小胶质细胞内源性UCP2后,可以加剧RBC lysate导致的小胶质细胞炎症。5)UCP2-shRNA降低小鼠纹状体内源性UCP2表达量,并在脑出血后加重脑水肿,升高纹状体内炎症因子IL-1 β、IL-6、TNF-α表达,加重神经炎症反应。结论:内源性UCP2在脑出血后被血液成分激活,内源性UCP2激活可抑制脑出血后小胶质细胞介导的神经炎症。第二部分 外源性线粒体解偶联剂减轻脑出血后小胶质细胞介导的炎性损伤目的:研究外源性线粒体解偶联剂对脑出血后小胶质细胞介导的神经炎症的作用以及对脑出血的治疗效果。方法:1)在细胞实验中,以红细胞裂解液(RBC Lysate)处理BV2小胶质细胞,以模拟小胶质细胞在脑出血后的激活,采用ELISA技术检测外源性线粒体解偶联剂氯硝柳胺(Niclosamide,Nic)能否抑制RBC Lysate导致的小胶质细胞炎症。2)为探究氯硝柳胺是否通过线粒体解偶联途径,采用ATP试剂盒检测ATP含量,采用荧光探针四甲基罗丹明乙酯(TMRM)检测BV2小胶质细胞中的线粒体膜电位。3)为探究氯硝柳胺是否可以减轻小鼠脑出血后的炎性损伤,检测脑出血3天后的脑组织含水量、神经功能损伤以及脑出血部位纹状体的炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)表达水平。4)为进一步探究结构不同的线粒体解偶联剂FCCP是否也可以减轻小鼠脑出血后的炎性损伤,检测脑出血3天后的脑组织含水量、神经功能损伤以及脑出血部位纹状体的炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)表达水平。结果:1)氯硝柳胺显著降低经RBC Lysate处理的BV2小胶质细胞释放的IL-1β、TNF-α和IL-6炎症介质水平,并具有剂量依赖性。2)氯硝柳胺降低小胶质细胞细胞内ATP合成能力,增加ADP/ATP比率,同时氯硝柳胺降低BV2小胶质细胞的线粒体膜电位。3)氯硝柳胺降低小鼠脑出血后的脑组织含水量,减轻神经功能损伤,降低出血侧脑组织中IL-1β、TNF-α和IL-6等炎症介质的表达水平。4)结构不同的解偶联剂FCCP也降低小鼠脑出血后的脑组织含水量,减轻神经功能损伤,降低出血侧脑组织中IL-1β、TNF-α和IL-6等炎症介质的表达水平。结论:外源性线粒体解偶联剂能够抑制脑出血后小胶质细胞介导的神经炎症,并改善脑出血后的神经损伤。第三部分 外源性线粒体解偶联剂通过激活AMPK抑制脑出血后小胶质细胞介导的神经炎症目的:基于线粒体解偶联剂降低细胞内ATP水平,而ATP下降是激活AMPK的重要机制,本课题将探讨外源性线粒体解偶联剂通过AMPK活化抑制脑出血后神经炎症的机制。方法:1)在细胞实验中,为探究氯硝柳胺是否通过激活AMPK(AMP-activated proteinkinase)降低脑出血后小胶质细胞引起的炎症反应,采用western blot技术检测氯硝柳胺在红细胞裂解液(RBCLysate)处理BV2小胶质细胞后能否促进AMPK活化(磷酸化)水平的上升。在小鼠脑出血后,以western blot技术检测氯硝柳胺能否升高脑出血部位AMPK活化水平。2)应用针对AMPK的小干扰RNA(AMPK-siRNA)敲减BV2小胶质细胞的AMPK,经RBCLysate刺激和氯硝柳胺处理,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测AMPK-siRNA组与Ctrl-siRNA组的炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)表达水平变化,以探究敲减AMPK是否阻断了氯硝柳胺减轻RBC Lysate引起的细胞炎症的作用。3)在动物实验中,为探究氯硝柳胺是否通过激活AMPK降低小鼠脑出血后引起的炎症反应。应用慢病毒介导的茎环干扰RNA(AMPK-shRNA)敲减小鼠纹状体内源性AMPK表达,检测纹状体内AMPK敲除效率。4)以AMPK-shRNA敲减小鼠纹状体的AMPK表达14天后,以胶原酶诱导脑出血。经氯硝柳胺处理,脑出血3天后采用ELISA技术检测炎症水平;同时在术后6h、1天、3天进行神经行为学测评(神经功能缺损评分、转角实验、前肢放置实验);并在术后3天取脑组织根据干湿比重计算脑组织含水量以评估脑水肿情况。5)为探究氯硝柳胺在脑出血后是否抑制AMPK下游的mTOR活化,采用western blot技术检测脑出血3天后出血侧纹状体和对侧纹状体的mTOR底物S6的活化水平。结果:1)与对照组相比,经红细胞裂解液处理,加入氯硝柳胺后BV2小胶质细胞的AMPK活化水平升高。在小鼠脑出血后,氯硝柳胺也显著升高脑出血部位纹状体AMPK的活化水平。2)与转染Ctrl-siRNA的对照组相比,在转染AMPK-siRNA的BV2小胶质细胞中,氯硝柳胺抑制RBC Lysate诱导的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平升高的作用被阻断。3)在动物水平,与对照shRNA(Ctrl-shRNA)相比,慢病毒介导的AMPK-shRNA显著降低小鼠纹状体内源性AMPK表达水平。4)敲减内源性AMPK表达后,氯硝柳胺降低小鼠脑出血后炎症反应的作用被阻断;AMPK-shRNA同时阻断了氯硝柳胺减轻出血后脑水肿和减轻神经功能损伤的作用。5)脑出血3天后,氯硝柳胺降低出血侧纹状体S6的磷酸化水平。结论:外源性线粒体解偶联剂氯硝柳胺通过激活AMPK抑制脑出血后小胶质细胞介导的神经炎症。