论文部分内容阅读
目的：本研究旨在探索库欣综合征(Cushing’s syndrome, CS)的两种病因ACTH-非依赖性肾上腺大结节增生(adrenocorticotropin-independent macronodular adrenal hyperplasia, AIMAH)和肾上腺皮质腺瘤中相关microRNAs差异表达,探讨其对肾上腺皮质细胞增殖及凋亡的影响,并初步分析其可能的靶基因。材料和方法：入组标本共57例,全部来自我院住院患者,其中AIMAH40例,肾上腺皮质腺瘤7例,正常肾上腺组织10例。第一部分：5例AIMAH和5例正常肾上腺皮质标本(作为阴性对照组)入组,使用microRNAs芯片(exiqon公司,版本8.0),筛选AIMAH组织与正常肾上腺组织之间差异表达的microRNAs。采用实时荧光定量PCR方法,在AIMAH、肾上腺皮质腺瘤组织中验证得到的microRNAs芯片结果,找出二者之间是否存在相同的microRNAs差异表达。第二部分：在第一步研究基础上,探索AIMAH和肾上腺皮质腺瘤中相关差异表达的microRNAs功能,并利用生物信息学方法筛选特异microRNAs可能的靶基因。选择第一部分中验证的microRNAs为目标,合成相应的mimics及inhibitors,将其转染入SW-13细胞系(肾上腺皮质腺癌细胞系),使目标microRNAs过表达或敲低目标microRNAs,以未经转染组为阴性对照。采用实时荧光定量PCR方法检测SW-13细胞中相应的microRNAs变化,确认microRNAs转染效果。使用MTT法检测转染对细胞增殖的影响。使用Annexin V-FITC/PI双染法检测转染对细胞凋亡的影响。找出对细胞增殖及凋亡有影响的microRNAs,将其定为目标microRNAs。通过生物信息学方法检索,主要为targetscan (http://www.targetscan.org/)和miRBase (http://www.mirbase.org/)两个数据库,初步得出该microRNAs可能的靶基因。结果：第一部分芯片结果显示AIMAH组织与正常肾上腺组织之间差异表达的microRNAs为12个,其中上调的microRNAs7个为：hsa-miR-663a、hsa-miR-498、 hsa-miR-638、hsa-miR-501-5p、hsa-miR-585、hsa-miR-557、hsa-miR-144;下调的microRNAs5个：hsa-miR-744、hsa-miR-143、hsa-miR-26a、hsa-miR-22、hsa-miR-29a。进一步采用实时荧光定量PCR方法,验证AIMAH、肾上腺皮质腺瘤二者之间相同的microRNAs差异表达共4个,上调的microRNAs3个：hsa-miR-663a; hsa-miR-498; hsa-miR-577;下调的microRNAs1个：hsa-miR-744-5p,提示这两种疾病之间存在相关的microRNAs差异表达。第二部分,选择上调的3个microRNAs:hsa-miR-663a、hsa-miR-498、hsa-mi R-577;下调的1个microRNAs:hsa-miR-744-5p作为目标microRNAs。合成相应的microRNAs mimics和inhibitors,经转染SW-13细胞系后,采用实时荧光定量PCR方法验证,与未经转染的细胞系相比,mimics转染组四个microRNAs均显示明显过表达。Inhibitors组四个microRNAs均显示明显表达敲低。MTT结果显示,过表达hsa-miR-663a可明显促进细胞增殖,其余nicroRNAs过表达后对细胞增殖影响不显著。敲低microRNAs后,hsa-miR-663a组和hsa-miR-577组细胞增殖明显减慢。细胞凋亡结果显示,过表达miR-744细胞凋亡轻度增加；敲低miR-663a后细胞凋亡轻度增加,敲低miR-577、miR-498后细胞凋亡轻度减少,但统计学上差异均无显著性。选择对细胞增殖有显著影响的hsa-miR-663a为目标microRNAs,通过生物信息学方法检测后发现miRBase数据库中该microRNAs共有61个靶基因,TargetScan数据库中有68个靶基因,二者重复的靶基因5个包括,DPF1、GRIN2D、PRRT1、SLC17A7和ZNF385A。进行文献检索初步探索基因功能。根据文献报道,SLC17A7基因在激素的释放中可能起到一定的作用。数据以均数±标准差(x±s)表示,并采用SPSS13.0软件进行统计学分析,t检验选择P<0.05时差异具有统计学意义。结论：与正常肾上腺皮质相比,AIMAH和肾上腺皮质腺瘤中存在相同的microRNAs差异表达。过表达hsa-miR-663a可以促进SW-13细胞系增殖,敲低可以使SW-13细胞系增殖减慢,其可能的靶基因为DPF1、GRIN2D、PRRT1、SLC17A7和ZNF385A。根据文献报道SLC17A7基因可能在肾上腺皮质激素的释放中起到一定的作用。其余microRNAs对肾上腺皮质细胞增殖及凋亡影响不显著。