【摘 要】
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支链氨基酸是机体的必需氨基酸。本论文以尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为研究对象,研究营养变化时尼罗罗非鱼骨骼肌支链氨基酸代谢适应变化规律及其调控机制。我们采用实时荧光定量PCR、氨基酸含量测定、相关酶活性测定及双荧光素酶报告基因检测等实验技术,分析了短期饥饿对尼罗罗非鱼骨骼肌支链氨基酸分解代谢的影响。通过活体注射LNA-125i等实验筛选和证实了Kruppel样因子15（
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支链氨基酸是机体的必需氨基酸。本论文以尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为研究对象,研究营养变化时尼罗罗非鱼骨骼肌支链氨基酸代谢适应变化规律及其调控机制。我们采用实时荧光定量PCR、氨基酸含量测定、相关酶活性测定及双荧光素酶报告基因检测等实验技术,分析了短期饥饿对尼罗罗非鱼骨骼肌支链氨基酸分解代谢的影响。通过活体注射LNA-125i等实验筛选和证实了Kruppel样因子15（Kruppel-like factor 15,KLF15）的上游关键调控因子micro RNA-125（mi R-125）,初步阐明了mi R-125a-3p-KLF15-BCAA通路在骨骼肌支链氨基酸分解代谢中的调控作用。本研究具体结果如下:1、通过实时荧光定量PCR技术检测了8个Kruppel样因子家族成员在尼罗罗非鱼尼罗罗非鱼的骨骼肌、肝、肾、肠道、脑、脾和心脏7个组织器官中m RNA的相对表达量情况,结果显示:KLF家族成员在尼罗罗非鱼的各种组织器官内都有分布,而相较于其他7个基因,KLF15基因在尼罗罗非鱼各组织器官中的表达量都相对较高,而且KLF15基因m RNA的相对表达量在骨骼肌中最高。2、经过3d饥饿的尼罗罗非鱼骨骼肌内KLF15基因、支链氨基酸转氨酶（Branched chain aminotransferase 2,BCAT2）基因、丙氨酸转氨酶（Alanine transaminase,ALT）基因m RNA的相对表达量显著高于对照组（P＜0.05）;通过氨基酸含量的检测和酶活检测发现,饥饿3d的尼罗罗非鱼骨骼肌中支链氨基酸的含量显著低于对照组（P＜0.05）,但ALT酶活性显著高于对照组（P＜0.05）。3、饥饿7d的尼罗罗非鱼骨骼肌内KLF15基因、BCAT2基因和ALT基因m RNA的相对表达量分别显著低于饥饿3d者（P＜0.05）;然而,骨骼肌内支链氨基酸的含量显著上升（P＜0.05）;ALT酶活性显著下降（P＜0.05）。4、饥饿15d的尼罗罗非鱼骨骼肌中的KLF15基因、BCAT2基因、ALT基因m RNA的相对表达量分别显著低于饥饿7d者（P＜0.05）;但是,肌肉中支链氨基酸的含量及ALT酶活性显著高于饥饿7d者（P＜0.05）,与饥饿0d的对照组没有显著差异（P＞0.05）。5、通过双荧光素酶报告基因检测证实,mi R-125a-3p能够负调控骨骼肌中KLF15基因的表达,体外实验确定KLF15基因是mi R-125a-3p的靶基因。6、与对照组相比,腹腔注射mi R-125a-3p特异性抑制剂（LNA-125i）的尼罗罗非鱼mi R-125a-3p m RNA的相对表达量降低;但是,KLF15基因、BCAT2基因和ALT基因的相对表达量显著升高（P＜0.05）;注射后的骨骼肌中支链氨基酸的含量显著下降（P＜0.05）;ALT酶活性显著上升（P＜0.05）。活体注射实验验证了mi R-125a-3p可以通过靶向KLF15基因来调控尼罗罗非鱼骨骼肌支链氨基酸代谢。以上结果初步揭示了在短期饥饿过程中尼罗罗非鱼骨骼肌BCAA代谢适应性变化规律,初步阐明了mi R-125a-3p-KLF15-BCAA通路在骨骼肌支链氨基酸分解代谢中的调控功能,为进一步了解尼罗罗非鱼骨骼肌支链氨基酸代谢及其调控机制提供了科学依据和参考。
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