[研究背景及目的]全世界约有3.5亿乙型肝炎病毒(HBV)感染者,其中9300万来自中国1,2。慢性HBV感染可出现一系列的临床表现,而重型肝炎(肝衰竭)则是其中最为严重的疾病状态。HBV诱导的慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)是肝衰竭的表现形式之一,其发病机制仍不十分明确,尽管参与疾病发生发展的因素很多,但免疫介导的肝损伤在此过程中发挥重要作用的观点已被广泛接受。其中,病毒特异性细胞毒性T细胞(CTL)在HBV诱导肝损伤机制中发挥重要作用3-5。研究表明,HBV-ACLF患者肝组织内可见大量CTL浸润,针对HBV各类抗原表位的特异性CTL作为主要的效应细胞,与病毒清除和细胞损伤直接相关,而由超强CTL活化继而触发一系列炎性效应是肝细胞大量坏死从而形成重型乙型肝炎的分子细胞机制之一。目前认为与参与乙型肝炎重症化机制的多种因素,均直接或者间接调节并影响T细胞免疫应答,从而最终导致重型肝炎的发生。另外,本实验室的前期研究工作首次阐述,在病毒诱导的急性肝衰竭中,NK细胞在肝脏大量聚集,并通过Fas/FasL和NKG2D/NKG2DL途径增强对肝细胞的杀伤,为深入研究NK细胞在重型乙型肝炎发病机制中的作用奠定了基础。为了进一步探讨重型乙型肝炎的分子学及免疫学机制,本实验室的前期研究利用人全基因组芯片技术(包含8600个探针),分析了HBV诱导的慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者和轻中度慢性乙型肝炎(Mild/Morderate CHB)患者外周血单个核细胞(PBMC)的基因表达谱差异,筛选出了在HBV-ACLF患者PBMC中增高表达的263种基因。其中,离子通道相关基因KCNJ15(Potassium Inwardly-rectifying Channel, Subfamily J, Member15)和KCTD9(Potassium Channel Tetramerisation Domain Containning9)在重型肝炎中表达分别上调7倍和6倍。KCNJ15是内向整流钾离子通道家族(KIR)的一员,也被称为KIR4.2。目前发现的人类KCNJ15基因主要有3个异构体,但编码的蛋白是完全相同的。KCNJ15蛋白是完整的细胞膜蛋白,其功能更倾向于使钾离子流向细胞内而非细胞外。目前关于KCNJ15的研究主要集中于其对靶细胞电位的影响。关于KCNJ15在病毒性肝炎中的研究尚未见报道。[研究目的]本研究的主要目标是探讨KCNJ15分子在重型乙型肝炎发生发展过程中的作用及作用机制。[研究内容]本研究主要分为两个部分,具体研究内容如下：一、钾离子通道基因KCNJ15在重型乙型肝炎中的作用及其免疫学机制研究1、以HBV-ACLF患者为对象的研究。(1)收集HBV-ACLF患者和轻中度CHB患者外周血PBMC,检测KCNJ15基因及蛋白水平的表达情况；(2)收集HBV-ACLF患者和轻中度CHB患者肝组织穿刺标本,检测KCNJ15在肝脏的表达情况；(3)对表达KCNJ15的淋巴细胞亚群进行定位,分析其表达与疾病进程之间的关系。2、利用人Jurkat细胞系进行KCNJ15分子的免疫学功能研究。3、以MHV-3诱导的Balb/cJ小鼠暴发型肝炎模型为对象的研究。在小鼠暴发型肝炎模型中观察随着疾病进展,KCNJ15在肝组织及肝脏淋巴细胞的表达情况及淋巴细胞亚群定位,研究KCNJ15参与MHV-3诱导的暴发型肝炎肝损伤的作用机制及潜在的干预效应。基于第一部分的研究结果,我们发现KCNJ15可能通过影响细胞因子IL-17的分泌,进而参与重型病毒性肝炎肝损伤机制,在此基础上,我们开展了第二部分的研究：二、IL-17在MHV-3诱导的小鼠暴发型肝炎模型中的作用1、在小鼠暴发型肝炎模型中观察感染后小鼠肝脏及外周血IL-17的表达水平；2、在小鼠暴发型肝炎模型中观察随着疾病进展肝脏淋巴细胞亚群IL-17的表达情况；3、分析IL-17表达水平与疾病严重程度的相关性；4、检测MHV-3诱导的暴发型肝炎小鼠肝脏Th17细胞分泌细胞因子水平的动态变化。[研究方法]1、利用实时定量PCR技术,检测HBV-ACLF患者、轻中度CHB患者外周血PBMC中KCNJ15mRNA相对定量水平。分别利用免疫细胞化学和免疫组织化学技术,检测HBV-ACLF患者和轻中度CHB患者PBMC及肝脏组织中KCNJ15的表达情况。利用流式细胞术检测KCNJ15分子在HBV-ACLF患者和轻中度CHB患者外周血各淋巴细胞亚群的表达水平；同时利用免疫荧光双染技术检测HBV-ACLF及轻中度CHB患者肝组织标本中CD4’T细胞表达KCNJ15的情况。2、利用Jurkat细胞系,将人KCNJ15表达质粒电转染入该细胞,流式细胞术观察转染48小时后Jurkat细胞上清细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-9、TNF-α、IFN-γ、IL-17的分泌水平；利用流式细胞术检测转染后Jurkat细胞胞内钙离子水平。3、通过荧光实时定量PCR、免疫组化、流式细胞术等技术,检测KCNJ15基因在MHV-3诱导的小鼠暴发型肝炎模型中的表达。4、利用MHV-3诱导的小鼠暴发型肝炎模型,通过荧光实时定量PCR及ELISA检测在外周血及肝组织中IL-17基因和蛋白水平。通过胞内因子染色和流式细胞术,检测感染后不同时间点表达IL-17的肝脏淋巴细胞亚群比例及肝脏Th17细胞分泌细胞因子IL-6/21/22的水平。[实验结果]1、通过从基因和蛋白水平检测HBV-ACLF患者、轻中度CHB患者的PBMC中KCNJ15分子的表达水平,及两类患者肝组织中KCNJ15表达水平,发现KCNJ15在HBV-ACLF患者外周血PBMC及肝组织中表达显著增高。2、KCNJ15在HBV-ACLF患者外周血及肝脏淋巴细胞,尤其是CD4+T细胞中的表达水平较轻中度CHB患者显著升高。3、KCNJ15分子在MHV-3病毒感染后的小鼠肝组织中高度表达；随着MHV-3感染时间的延长,表达KCNJ15的肝脏CD4+T及CD8+T细胞比例于48小时显著升高；而表达KCNJ15的肝脏NK细胞比例则于感染后24小时达峰值。4、随着MHV-3感染时间的延长,外周血和肝组织中IL-17表达水平,以及表达IL-17的肝脏CD4+T细胞与CD8+T细胞比例逐渐升高,于72小时达峰值。肝脏及血清IL-17的水平与反映肝损伤程度的ALT水平紧密相关。感染后72小时肝脏Th17细胞分泌细胞因子IL-6、IL-21、IL-22的水平显著升高。5、利用人KCNJ15表达质粒电转染Jurkat细胞系后,Jurkat细胞分泌IL-17水平显著增加；同时转染后Jurkat细胞胞内钙离子水平显著升高。[结论]1、本研究证实KCNJ15在HBV-ACLF患者外周血及肝组织CD4+T细胞中表达显著增高。2、本研究证实KCNJ15分子在MHV-3病毒感染后的小鼠肝组织和肝脏T淋巴细胞中高度表达,与前期人类重型乙型肝炎的研究结果相似,提示可利用该模型深入研究KCNJ15参与HBV病毒诱导的重型肝炎肝细胞损伤发生发展中的作用及机制。3、MHV-3诱导的暴发型肝炎模型中,肝脏和外周血IL-17表达水平增高,以及肝脏Th17细胞比例及分泌细胞因子水平的升高,可能参与病毒诱导的肝脏损伤的病理过程。4、体外研究阐明了转染KCNJ15表达质粒的Jurkat细胞胞内钙离子浓度升高,同时分泌IL-17水平上升,推测KCNJ15可能通过调节T细胞钙离子水平影响其IL-17分泌功能,但其涉及的机制需进一步研究探讨。