【摘 要】
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癌症是全球性的健康问题,其发生、发展、转移灶形成和放化疗失败的主要原因是癌组织中存在癌症干细胞（Cancer Stem Cells,CSCs）。CSCs具有迁移侵袭性、自我更新、强耐药性和强致瘤性等特性,是科研和临床癌症研究和治疗的热点和难点。用传统的二维培养体系研究CSCs,导致CSCs部分特性丢失,而无法有效维持CSCs含量。与二维细胞培养相比,三维细胞培养能够重现体内部分微环境,且有利于CS
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癌症是全球性的健康问题,其发生、发展、转移灶形成和放化疗失败的主要原因是癌组织中存在癌症干细胞（Cancer Stem Cells,CSCs）。CSCs具有迁移侵袭性、自我更新、强耐药性和强致瘤性等特性,是科研和临床癌症研究和治疗的热点和难点。用传统的二维培养体系研究CSCs,导致CSCs部分特性丢失,而无法有效维持CSCs含量。与二维细胞培养相比,三维细胞培养能够重现体内部分微环境,且有利于CSCs特性的表达与维持,是体外研究CSCs较为理想的方式之一。（-）-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（（-）-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG）是绿茶中主要的天然活性成分之一,具有抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡等药理学作用。因此,本研究以三维培养体系为基础,通过探究EGCG对乳腺癌、肝癌CSCs迁移性和自我更新等特性的影响,主要得到以下结果:1.利用胶原海绵构建乳腺癌细胞系MCF-7的三维培养,通过MTT法检测不同浓度EGCG对乳腺癌CSCs增殖的抑制效应,当EGCG浓度小于80μM时,对乳腺癌CSCs的增殖无影响（P＞0.05）;而当EGCG浓度大于80μM时,CSCs的增殖被显著抑制（P＜0.05）。q RT-PCR实验结果发现EGCG能抑制乳腺癌CSCs Snail、Twist1、ZEB1等间质细胞标志基因的表达,促进其上皮细胞标志基因E-Cadherin的表达,并通过划痕修复和Transwell实验进一步说明EGCG对乳腺癌CSCs的迁移能力具有显著的抑制效应（P＜0.05）。同时,q RT-PCR实验结果表明EGCG能够下调乳腺癌CSCs干细胞标志基因的转录水平,并且EGCG能够抑制乳腺癌CSCs单克隆形成和克隆形成能力（P＜0.05）,说明EGCG能够抑制CSCs的自我更新能力。此外,流式细胞术结果显示EGCG明显降低乳腺癌MCF-7的CD24-类CSCs的含量（P＜0.05）。2.将猪肝组织制备成为多孔状三维支架材料。通过HE和DNA含量测发现,该三维支架材料中无细胞残留。在三维支架上接种肝癌细胞Hep G2进行三维培养,体视显微镜和激光共聚焦显微镜观察到细胞形成多层细胞结构,MTT实验进一步确定该三维支架材料适合肝癌细胞Hep G2生长。q RT-PCR检测发现,三维培养下,Hep G2的迁移相关基因和干细胞标志基因的m RNA转录水平均明显上调。而且,Transwell的穿膜细胞数量、单克隆形成数量和克隆形成数量显著增多。这表明该材料是体外研究肝癌CSCs理想的三维细胞培养材料。通过MTT法探究EGCG对肝癌CSCs增殖的影响,发现EGCG浓度低于80μM时,对肝癌CSCs增殖的影响差异不显著（P＞0.05）;而当EGCG浓度高于80μM时,CSCs的增殖被显著抑制（P＜0.05）。q RT-PCR实验结果发现EGCG能抑制肝癌CSCs迁移性基因的表达。Transwell实验结果显示,EGCG能显著抑制肝癌CSCs迁移的细胞数量（P＜0.05）,进一步说明EGCG对肝癌CSCs的迁移能力具有抑制效应。同时,q RT-PCR实验结果表明EGCG能够抑制肝癌CSCs干细胞标志基因的m RNA表达水平。此外,EGCG还能够显著抑制肝癌CSCs的单克隆和克隆的形成数量（P＜0.05）,这说明EGCG能够抑制CSCs的自我更新能力。本研究以三维培养体系为基础,通过探索EGCG对乳腺癌、肝癌CSCs迁移和自我更新等特性的影响,进一步确定了EGCG对CSCs抑制效应,为后续小鼠体内实验奠定基础,也为EGCG应用于临床治疗癌症和新药开发提供理论依据。
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