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实验目的： 卵巢癌是女性生殖系统常见的三大癌症之一，死亡率居妇科癌症首位。其早期症状隐匿、易发生多脏器移植、淋巴结转移，确诊时70％已属晚期，5年生存率低。卵巢癌的侵袭及转移是造成其治疗困难、死亡率高的主要原因。Wnt信号通路在胚胎发育、干细胞、免疫系统以及肿瘤发生等生理病理过程中发挥重要作用。作为Wnt信号通路的辅助受体，低密度脂蛋白受体相关蛋白5（Low densitylipoprotein Receptor related-Protein5，LRP5）与骨形成以及肿瘤发生密切相关，现已成为新的药物靶点之一。通过病人卵巢癌组织样本及细胞株筛查发现LRP5在多种高转移细胞株中呈现高表达，提示LRP5可能与肿瘤的浸润转移有关。因此我们拟通过LRP5的显性负突变体DN-LRP5阻断LRP5介导的Wnt信号通路，从而研究DN-LRP5对卵巢癌的体内外抗癌活性，并对其分子机制进行初步探索。 实验方法： 1.通过亚克隆构建pLVX-IRES-zsGreen1-DN-LRP5及pLVX-puro-DN-LRP5慢病毒表达载体。利用慢病毒系统获得病毒液并感染HEK293T细胞后，分别通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达以及Western blot验证DN-LRP5（MYC标签）在细胞中的正确表达。最后将重组慢病毒悬液感染卵巢癌HO8910PM细胞，并用嘌呤霉素筛选。 2.增殖抑制分析:通过MTT实验考察DN-LRP5对HO8910PM细胞生长的影响。 3.细胞迁移的检测:通过Transwell assay及Scratch assay检测DN-LRP5对HO8910PM细胞迁移的影响。 4.免疫荧光染色:FITC-鬼笔环肽细胞免疫荧光染色观察DN-LRP5对细胞骨架的影响。 5.Western blot及明胶酶谱:通过Western blot检测DN-LRP5对HO8910PM细胞上皮标志蛋白、间质标志蛋白表达的影响;通过明胶酶谱实验确定DN-LRP5对MMP2/9酶活性的影响。 6.裸鼠体内实验:通过皮下及尾静脉接种HO8910PM/pLVX及HO8910PM/DN-LRP5细胞，检测LRP5对肿瘤的生长及转移的影响。 实验结果： 1.通过 Lenti-X Lentiviral Expression Systems制备pLVX-IRES-zsGreen1-DN-LRP5及pLVX-puro-DN-LRP5的重组慢病毒悬液，并感染HEK293T细胞，分别通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达以及Western blot验证DN-LRP5(MYC标签)在细胞中的正确表达。将DN-LRP5重组慢病毒悬液感染卵巢癌HO8910PM细胞，并在嘌呤霉素筛选后建立稳定表达DN-LRP5的细胞系。 2.增殖抑制分析:与HO8910PM/pLVX对比，HO8910PM/DN-LRP5在细胞铺板后的第3天、5天的生长速率显著降低，第3天抑制率为42.5％，第5天抑制率为56.1％(P＜0.05)。 3.细胞迁移的检测:通过Transwell assay及Scratch assay可以看出DN-LRP5能够显著的抑制HO8910PM细胞的迁移，抑制率45％及66％(P＜0.05)。 4.免疫荧光染色:细胞铺板16 h后，FITC-鬼笔环肽及DAPI染色显示，空载体对照组HO8910PM/pLVX胞体周围伸出伪足，而HO8910PM/DN-LRP5并没有明显的伪足出现。 5.LRP5分子机制初探:首先，通过Western blot，发现DN-LRP5能够引起HO8910PM细胞中EMT相关蛋白的表达发生变化。与HO8910PM/pLVX对比，HO8910PM/DN-LRP5中上皮标志蛋白E-cadherin、Keratin8/18的表达量明显上调，间质标志蛋白Vimentin、Fibronectin的表达明显下调。另外，明胶酶谱结果显示，DN-LRP5使得MMP2/9的酶活性明显下降。同时也发现，DN-LRP5抑制β-catenin的表达，降低TCF/LEF转录活性。其次，对与Wnt信号通路相关的其他信号通路进行初步探索，发现DN-LRP5能够下调 Phospho-Met(Tyr1234/1235)，同时DN-LRP5也抑制了Met下游的Phospho-p38MAPK(Thr180/Tyr182)及Phospho-Akt(Ser473)的表达。 6.裸鼠体内实验:裸鼠皮下及尾静脉注射HO8910PM/pLVX及HO8910PM/DN-LRP5细胞，发现接种HO8910PM/DN-LRP5的肿瘤瘤块体积明显小于HO8910PM/pLVX，DN-LRP5的对肿瘤的抑制率为83％(P＜0.05);尾静脉注射HO8910PM/pLVX细胞的裸鼠的肺部出现大量的肿瘤，而注射HO8910PM/DN-LRP5的裸鼠只有少量的结节，抑制率为87％(P＜0.05)。 结论： 成功构建了慢病毒表达载体pLVX-IRES-zsGreen1-DN-LRP5及pLVX-puro-DN-LRP5，通过嘌呤霉素筛选获得了卵巢癌HO8910PM稳定细胞株，并初步探讨了LRP5对HO8910PM细胞生长及迁移的影响及其分子机制。DN-LRP5能够显著抑制HO8910PM细胞的生长，抑制率为56.1％(P＜0.05)，同时引起上皮标志蛋白上调，间质标志蛋白的下调，通过逆转EMT过程抑制细胞的迁移，此外，通过裸鼠体内实验进一步表明，DN-LRP5可显著的抑制肿瘤的生长及转移，抑制率分别为83％及87％(P＜0.05)。LRP5通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制HO8910PM的生长及迁移。