论文部分内容阅读
【背景与目的】炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD),是一类慢性非特异性肠道炎症性疾病,目前其病因及发病机制尚不完全明确。IBD患者及实验性模型鼠在有肠道炎症的同时存在一定程度的肠粘膜屏障(intestinal epithelial barrier,IEB)损伤。肠粘膜屏障作为机体抵御外来物质入侵的第一道防线,主要由完整的肠上皮及上皮间紧密连接(tight junction,TJ)等构成。TJ蛋白与肌动蛋白细胞骨架形成复合物,对调节肠粘膜通透性至关重要。而肌动蛋白的收缩与舒张主要依赖肌球蛋白轻链(myosin II regulation light chain,MLC)的调节,肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)诱导MLC磷酸化后,可收缩肌动蛋白,TJ开放。芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,Ah R)是一种配体依赖的转录因子,在维持肠道免疫屏障,介导炎症反应中发挥重要作用。本研究拟通过建立2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)诱导的结肠炎模型,及体外构建TNF-α诱导的Caco2细胞紧密连接损伤模型,观察Ah R对肠粘膜屏障功能及肠道炎症的影响并探讨其可能的机制。【方法】1.动物实验1.1分组:选取雄性8-10周龄的C57BL/6野生型(wild type,WT)鼠及Ah R敲基因(Ah R-/-)鼠共36只,分别随机分为WT空白对照组(WT CTRL)、Ah R-/-空白对照组(Ah R-/-CTRL)、WT乙醇对照组(WT ETOH)、Ah R-/-乙醇对照组(Ah R-/-ETOH)、WT模型组(WT TNBS)和Ah R-/-模型组(Ah R-/-TNBS),每组6只。1.2小鼠TNBS模型建立:TNBS组采用等体积无水乙醇配制成2.5%TNBS/乙醇溶液后进行灌肠,乙醇对照组采用50%乙醇溶液进行灌肠,空白对照组采用生理盐水进行灌肠。1.3肠道炎症状态评估:观察各组小鼠体重变化、大便性状和大便隐血/肉眼血便情况,进行疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察组织形态学的变化,组织病理评分评估肠道炎症。1.4肠粘膜屏障功能评估:异硫氰酸荧光素-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-Dextran)示踪法检测小鼠肠粘膜屏障通透性;透射电子显微镜观察TJ及微绒毛超微结构;Western blot和免疫荧光检测TJ蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-1、JAM-A)的表达与分布。1.5 MLCK相关信号通路的检测:Western blot检测MLCK、MLC和p-MLC的表达。2.细胞实验2.1分组:选取Caco2细胞分为五组:空白对照组、TNF-α组(TNF-α50ng/m L)、DMSO/TNF-α组(DMSO、TNF-α50ng/m L)、FICZ/TNF-α组(FICZ 100n M、TNF-α50ng/m L)、CH223191/TNF-α组(CH223191 100n M、TNF-α50ng/m L)。2.2 FITC-Dextran示踪法检测Caco2细胞单层通透性;Western blot和免疫荧光检测TJ蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-1、JAM-A)的表达与分布;Western blot检测MLCK、MLC和p-MLC的表达。【结果】1.与对照组相比,TNBS模型组小鼠结肠粘膜充血、水肿、血便明显,其DAI评分显著增高(P<0.05),且Ah R-/-鼠TNBS造模后DAI评分较WT鼠TNBS造模后更为增高(P<0.05);HE染色可见大量炎细胞浸润,细胞明显水肿、变性,隐窝结构消失,组织病理评分明显升高(P<0.05);且Ah R-/-TNBS组肠道粘膜损伤较WT TNBS组更重,组织病理评分更为升高(P<0.05)。2.与对照组相比,TNBS模型组小鼠的FITC-Dextran渗透率显著增加(P<0.05);透射电子显微镜显示其肠上皮微绒毛结构紊乱,细胞间隙增宽,TJ形成“空泡样”结构;免疫荧光显示TJ荧光强度减弱,完整性遭到破坏;WB显示TJ蛋白表达明显减少;且Ah R-/-TNBS组的肠粘膜屏障通透性较WT TNBS组升高更明显(P<0.05),TJ超微结构破坏更为严重,蛋白表达减少明显。3.与对照组相比,TNBS造模后小鼠肠组织中MLCK和p-MLC蛋白表达明显增加(P<0.05);且Ah R-/-鼠肠组织中的MLCK和p-MLC表达较WT鼠升高更为明显(P<0.05)。4.体外TNF-α诱导的Caco2细胞紧密连接损伤模型实验,给予Ah R的配体激动剂FICZ后可以一定程度上修复TJ蛋白的完整性,上调TJ蛋白表达,降低肠粘膜通透性,并下调MLCK和p-MLC的表达;而给予Ah R抑制剂CH223191之后,TJ结构破坏更为明显,蛋白表达明显下降,肠粘膜通透性显著增加,MLCK和p-MLC表达明显增加(P<0.05)。【结论】Ah R缺失加重结肠炎模型鼠肠粘膜屏障的损伤,且该作用可能与调控MLCK信号通路相关。