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多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种中枢神经系统慢性炎症性脱髓鞘疾病,其典型的病理特征是炎性细胞浸润、髓鞘脱失、轴索变性及胶质细胞增生等。具有复发、缓解及致残率高等特点。由于MS病人的标本不易获取,限制了对该疾病的研究,因此建立合适的动物模型是研究MS发病机制、病理变化及治疗措施的关键。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)被公认为是MS的理想模型。目前国际上认为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein MOG)多肽片段诱导的EAE模型更能从发病机制上模拟MS;而且用MOG多肽片段免疫大鼠或小鼠逼真地再现了复发缓解(RR)型、原发进展(PP)型、继发进展(SP)型、Devic病、Marburg等各种类型MS的临床病程;其敏感鼠C57BL/6品系纯正、遗传背景知识全面、丰富,遗传学、免疫学等的研究也较深入,且较PL/J和SJL等其他小鼠价格便宜且国内易得。因此用MOG作为免疫原诱导C57BL/6小鼠能更好地为MS/EAE发病机制的阐明提供研究材料。目的:本实验旨在应用MOG35-55诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型,并观察其病程及不同时期的病理特点,为进一步研究MS的发病机制、病理特点及治疗措施提供一定的实验基础。方法:1动物分组:将24只8-10周雌性C57BL/6小鼠,体重18-20g,随机分为EAE组和正常对照组,其中正常对照组9只,EAE组15只。其中各组又分为急性期(EAE小鼠第一次发病症状达峰时)和慢性期(60天)两个亚组,EAE组急性期亚组为9只,慢性期亚组为6只;正常对照组急性期亚组3只,慢性期亚组6只。2模型制备:将抗原MOG35-55用生理盐水稀释成6mg/ml,并按1∶1等体积加入完全弗氏佐剂(其中结核杆菌H37Ra终浓度为4mg/ml)混合,乳化后按每只0.1ml于小鼠脊柱两侧分四点皮下注射,免疫当天即0h及第48h腹腔注射0.5ml PTX(1400ng/只)。免疫当天记为0天,免疫在乙醚麻醉及充分固定下进行。空白对照组9只,不作任何处理。3发病动物的评估:采用双盲法每日早晚(8∶00和16∶00)两次对小鼠进行称重、评估。Benson评分标准,0分:无任何临床症状;1分:尾部张力消失,可见轻度步态笨拙;2分:双后肢无力,被动翻身后可以恢复;3分:双后肢瘫痪,被动翻身后不能恢复,但给予刺激后可以挪动;4分:双后肢瘫痪,前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁;5分:濒死状态或死亡。症状介于两者标准之间者以土0.5计;“每日积分均值”由当日组内所有动物分值总和除以该组动物数量所得。4组织病理学:在动物麻醉状态下,急性期:EAE组取9只小鼠,正常对照组取3只;慢性期:各组各取3只,经水合氯醛麻醉后,4%多聚甲醛灌流,取脑和脊髓颈、胸、腰膨大处组织石蜡包埋,5μm连续切片,分别作HE染色、Mallory磷钨酸苏木素染色和Bielschowsky’s改良银染,8μm连续切片做LFB染色,光镜观察;另外,慢性期组再各取3只经电镜液灌注取脑和脊髓,4%戊二醛固定,制作超薄切片,电镜观察。结果:1本实验终止时,EAE组小鼠总发病率达100%,平均发病时间为(14.00±2.45)d,平均症状达峰时间为(18.75±4.10)d,最大症状评分为(2.42±0.66)分。在整个病程过程中,小鼠症状均出现复发缓解,平均复发次数为:(2.50±0.84),随着病程的进展,66.7%的小鼠临床评分恢复到0.5-1分;而33.3%的小鼠症状不再缓解,出现持续的神经功能障碍;2 EAE组和正常对照组小鼠的神经功能评分的均数分别为:1.28±0.70、0.00±0.00,两组比较EAE组小鼠的神经功能评分显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);3 EAE组和正常对照组小鼠体重的均数分别为19.27±0.87、20.99±1.55,两组比较EAE组小鼠体重显著减轻,差异具有统计学意义(P<0.05);4光镜下可见急性期和慢性期两个时期均有炎细胞浸润,急性期及慢性期炎症细胞浸润的均数分别为:17.33±4.63、28.50±8.09,对照组为:5.00±0.00,慢性期炎性细胞浸润明显,差异具有统计学意义(P<0.05);5 LFB染色观察急性期及慢性期均有不同程度的髓鞘脱失,急性期及慢性期均数分别为:31.33±3.31、18.83±5.00,对照组均数为:5.00±0.00,EAE组两个亚组和对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05);EAE组内急性期和慢性期相比,急性期脱髓鞘明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。6 Bielschowsky’s改良银染显示EAE组急性期和慢性期均有轴索肿胀、变性和轴索卵形体的形成;正常对照组轴索正常;7电镜下可见髓鞘板层结构松散、紊乱,甚至向内塌陷;髓鞘与轴索分离;还可以观察到不同程度的髓鞘再生;同时可见轴索内线粒体肿胀、轴索萎缩甚至消失。结论:本实验应用MOG35-55多肽片段诱导C57BL/6小鼠成功制备了RR-EAE动物模型,并观察了其完整的病程变化,与文献报道的慢性进展或者慢性非缓解病程不同,我们观察到了复发缓解现象;而且对各个时期的病理特点进行了初步的描述,为进行MS动物模型的选择及模型应用提供了实验基础。