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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge),又名赤参,为唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)多年生草本植物,其干燥的根及根茎可入药。作为我国常用的传统中药,丹参具有生育期短、易栽培、易繁殖、适应性强、基因组小、染色体数目少(2n=16)等特性,便于进行分子和遗传学等生物学分析。丹参作为中药研究的模式生物,与其相关的包括基因组测序、功能基因研究、药用成分分析、药效药理分析等研究得到广泛开展。本研究从形态学、细胞学角度,首次鉴定获得丹参的一种初级三体,并结合AFLP、RAPD分子标记方法,分析其DNA水平上的变化,进而为后续丹参整套初级三体的鉴定获得、丹参基因组计划的基因定位等研究奠定基础。主要结果如下:
1.从形态学、细胞学角度鉴定获得丹参的一种初级三体,该三体细胞中含有17条染色体,较普通二倍体丹参(2n=16)增加了一条额外染色体,即其染色体组成为2n+l,经核型分析初步确定额外染色体为8号染色体。
2.对比观察初级三体与二倍体丹参的性状,两者在叶形、株高等方面无明显差异,但花、根部形态特征表现显著差异,具体表现为:二倍体丹参花色为紫色,花冠呈明显二唇形,有两个可育雄蕊,而初级三体植株无花冠,且不具有可育雄蕊,表现为雄性不育;二倍体丹参的根部较小,分支较多,初级三体丹参的根部明显粗大,且分支少。
3.以初级三体丹参、二倍体丹参、三倍体丹参为材料进行遗传相似性分析,AFLP分析结果显示,从45对AFLP引物组合中筛选获得26对引物组合的扩增结果条带清晰,且差异条带稳定,共得到718个扩增位点,其中呈现多态性的位点共有278个,多态位点比率(PPB)分布在18.18%~66.67%范围内,平均为38.70%。利用NTSYS软件进行的聚类分析和遗传相似性系数分析结果显示,初级三体丹参与三倍体丹参间的遗传相似性系数为0.7938,而其与二倍体丹参间的遗传相似系数为0.7256,后者相对较小,即初级三体丹参与三倍体丹参的基因组组成相对接近。对17个扩增差异条带回收及克隆测序,测序结果在NCBI数据库中进行Blastx分析,共有12个差异片段的序列检索到同源性序列,涉及醇腈酶、逆转座子蛋白、未命名蛋白或假定蛋白等,另外5个差异片段未能检索到同源序列。
4.以初级三体丹参及二倍体丹参为材料进行RAPD分析,结果显示,从113个随机引物中筛选出34个随机引物,其扩增结果有差异明显条带,且在重复实验中较稳定。共得到232个扩增位点,其中130个位点呈现多态性,对其中5条差异条带回收并克隆测序,测序结果在NCBI数据库中进行Blastx分析,其中3个差异片段的序列检索到同源性序列,另外2个差异片段未能检索到同源序列。