研究背景膀胱癌是泌尿系统威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一,据美国癌症协会统计,在男性患者恶性肿瘤排名中,膀胱癌居第四位。在我国,男性膀胱癌发病率位居泌尿生殖系恶性肿瘤发病率第二位,居全身肿瘤的第八位。在膀胱癌患者中,有大约75%呈局限于黏膜层的浅表性肿瘤,25%呈浸润性肿瘤。目前对浸润性膀胱癌最有效地治疗是采用根治性全膀胱切除配合术后放化疗,但是在根治术后2年内约有50%的患者会发生复发、转移,并最终死于肿瘤。这可能是由于半数以上的膀胱移行细胞癌在肿瘤浸润至肌层时体内已有微转移灶存在,这些复发转移的患者对现有的治疗措施疗效甚微。因此,若能探寻一种新的治疗方法,能有效地控制甚至杀灭这些微转移病灶,必将大大提高浸润性膀胱癌的治疗效果。免疫治疗可能成为浸润性膀胱癌术后防止复发的有效治疗方法。曾有学者利用灭活肿瘤细胞作为疫苗来增强机体抗肿瘤能力。但由于肿瘤细胞免疫原性较弱,单纯利用灭活肿瘤细胞很难大幅度提高机体对肿瘤细胞的免疫力；之后随着对各种细胞因子(GM-CSF、IL-2、TNF-α)的研究发现,它们对于增强机体的抗原呈递能力,提高T细胞的活化和增殖能力均有一定的效果,并在后期通过动物实验给予证实。但由于细胞因子在体内代谢过快,而较大剂量则易导致一系列严重的副反应,因此极大的限制了其疗效的发挥,未能达到较为理想的治疗效果。于是,有学者开始研究将细胞因子和灭活肿瘤细胞通过一些方法更加牢固地结合在一起,从而将二者的抗肿瘤作用相结合。最常用的是基因转染(或转导)的方法。但是,基因转染(或转导)有其固有的缺陷：效率一般较低,致使治疗基因的蛋白质表达产物的有效浓度在体内难以达到并较长时间地维持；还存在潜在的病毒载体安全性问题。为克服上述存在的不足,本实验中我们运用一种新的蛋白质锚定技术：利用细胞表面蛋白质的氨基易生物素化以及生物素与链亲和素高效而强有力几乎不可逆的结合这两个特性,将链亲和素(SA)标记的细胞因子GM-CSF快速牢固的锚定在肿瘤细胞表面,使免疫刺激因子迅速永久地锚定在细胞的表面、并能使这些已锚定的免疫刺激因子仍保持它们的生物活性,新成一种新型肿瘤疫苗。链亲和素(SA)标记的GM-CSF膜锚定MB49膀胱肿瘤细胞治疗膀胱转移癌的方法目前尚无相关报道。本研究首先制备SA-GM-CSF膜锚定膀胱肿瘤细胞疫苗,并建立好小鼠MB49膀胱转移癌双模型,用已制备的新型肿瘤细胞疫苗对转移癌动物模型进行免疫治疗,之后通过多种检测方法,判断SA-GM-CSF膜锚定膀胱肿瘤细胞疫苗对膀胱转移癌的发生和发展的抑制作用及其可能的机制。目的探讨SA-GM-CSF膜锚定膀胱肿瘤细胞疫苗治疗实验性小鼠膀胱转移癌的疗效及其相关机制,探讨SA-GM-CSF膜锚定膀胱肿瘤细胞疫苗治疗的免疫保护作用。研究方法本研究分为两部分：一、SA-GM-CSF膜锚定膀胱肿瘤细胞疫苗的制备和检测选取生长良好的MB49膀胱肿瘤细胞,0.25%胰酶消化,离心后,采用30%酒精灭活肿瘤细胞30分钟,用0.4%台盼兰染色证实灭活效果。之后取MB49膀胱肿瘤细胞(2×107/m1)与生物素室温下反应60分钟,用1×PBS清洗三次。之后将生物素化的细胞与SA-GM-CSF按100ng/106 cells的比例反应1小时,1xPBS清洗三次。后加入结合藻红蛋白的抗GM-CSF单克隆抗体,利用流式细胞计数仪测定MB49膀胱肿瘤细胞表面SA-mGM-CSF的锚定率。之后选取上述制备好的MB49膀胱肿瘤细胞疫苗1×105,加至1ml 1×PBS中混匀,放入冻存管中反复冻融3次。然后在4℃、15000rpm/min条件下离心5分钟,把收集的细胞膜碎片混于0.5ml含血清的培养基中。将其按不同稀释浓度加入96孔板中,100ul/孔,设三个复孔,每孔加入C57小鼠骨髓瘤细胞1×104。同时设标准品GM-CSF组。于37℃,5%CO2培养箱中培养3天后,每孔加入20ul浓度为5mg/ml的MTT,振板摇匀。后继续于相同条件下培养箱中培养4小时后,每孔加入200ulDMSO终止反应。后选择OD570波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。二、动物实验的研究1、C57小鼠膀胱转移瘤双模型的建立(皮下模型和肺模型)皮下模型：利用标准皮下移植瘤模型制作方法,取8只C57雌鼠(6-8周),每只小鼠右侧腹股沟区皮下注射状态良好的MB49膀胱癌细胞100ul(浓度为1×107/m1)。从第5天开始,每隔5天监测一次皮下肿瘤大小,直至第30天。肺模型：采用尾静脉注射法建立小鼠肺转移癌模型。随机将C57雌性小鼠分为A-E五组(每组8只),每组每只小鼠尾静脉注射MB49膀胱肿瘤细胞量100ul,浓度分别为(A组：1×105/100ul,B组：2×105/100ul,C组：3×105/100ul,D组：4×105/100ul, E组：5×105/100ul)。2周后,解剖各组小鼠,取肺组织行病理HE染色。2、SA-GM-CSF膜锚定膀胱肿瘤细胞疫苗的免疫原性随机将C57BL/6小鼠分为五组(每组6只)：实验组：GM-CSF锚定的灭活MB49膀胱肿瘤细胞；对照组为：GFP锚定的灭活MB49膀胱肿瘤细胞组、单独GM-CSF组、单独灭活MB49膀胱肿瘤细胞组、PBS组。方法：每4天一次免疫治疗(后腿腹股沟处,左右腹股沟轮流皮内注射),连续4次,每次细胞疫苗数为1×106/100ul或PBS100ul,在最后一次治疗后的一周进行攻击(皮下组：右后腿腹股沟区皮下注射100ulMB49肿瘤细胞,浓度为1×107/ml；肺组：尾静脉注射100ulMB49肿瘤细胞,浓度为2×106/m1)。皮下组每5天测一次肿瘤大小；肺组每天观察生存期。3、SA-GM-CSF膜锚定膀胱肿瘤细胞疫苗功效的检测将状态良好的MB49膀胱肿瘤细胞按1×107/ml注射C57BL/6雌性小鼠(6-8周)右后腿皮下或按2×106/ml注射小鼠尾静脉(100ul/只),建立膀胱皮下转移癌和肺转移癌双模型。并于肿瘤细胞攻击当天,第四天,第八天,第十二天分别于左右腹股沟轮流皮内注射100ul浓度为1×107/ml的SA-GM-CSF锚定的灭活MB49膀胱肿瘤细胞疫苗。本实验共分五组,每组10只小鼠。其中SA-GM-CSF锚定的灭活MB49膀胱肿瘤细胞为实验组,对照组为：GFP锚定的灭活MB49膀胱肿瘤细胞组、单独SA-GM-CSF细胞因子组、单独灭活MB49膀胱肿瘤细胞组、PBS组。治疗结束一周后,每组随机抽取2只小鼠行脾细胞CTL,血液和肿瘤组织内CD4+和CD8+T淋巴细胞的检测,并继续观察小鼠皮下肿瘤大小变化及生存情况。4、疫苗诱导机体产生抗肿瘤免疫记忆及特异性免疫的检测1)、免疫记忆检测：小鼠膀胱转移癌规范疫苗治疗45天后,选取实验组符合标准的小鼠(皮下组：不长肿瘤的状态良好的小鼠；肺组：存活并状态良好的小鼠),给予右后退皮下注射MB49膀胱癌细胞100ul,(浓度为1×107/m1),每5天游标卡尺测量一次肿瘤大小,观察45天。未进行任何处理的健康小鼠作为对照组。2)、体内CTL检测：将实验组符合标准的小鼠(皮下组：不长肿瘤的状态良好的小鼠；肺组：存活并状态良好的小鼠)行左右两侧后腿分别RM-1前列腺癌细胞和MB49膀胱癌细胞皮下注射100ul(浓度均为1×107/m1),后每5天游标卡尺测量一次肿瘤大小,观察45天。3)、体外CTL检测：将实验组符合标准的小鼠分别取其脾脏,按照CTL检测方法,分别利用MB49膀胱癌细胞和RM-1前列腺癌细胞作为靶细胞,监测其对两种肿瘤细胞的杀伤能力。结果1、将抗GM-CSF单克隆抗体加入至制备好的SA-GM-CSF膜锚定膀胱肿瘤细胞疫苗中,后经过流式细胞仪的检测得出疫苗中细胞因子的锚定率为：95.6%。2、经过酶联免疫监测仪的测定,表明GM-CSF锚定于MB49膀胱肿瘤细胞后,仍能保持GM-CSF的活性。3、C57小鼠膀胱转移癌双模型的建立：通过对小鼠膀胱癌皮下转移和肺转移模型的监测,以及后期皮下肿瘤及肺肿瘤的病理及免疫组化检测,均证实建模成功,通过不同肿瘤细胞的注入,证实了小鼠M49膀胱肿瘤肺转移瘤模型建立的最小致瘤率为2×105/100ul。4、动物实验研究表明：(免疫原性)肿瘤体积大小检测：经统计软件SPSS17.0重复测量方差分析,F=101.675,P<0.01；时间和肿瘤体积有交互作用,F=57.005,P<0.01。说明各组体积的差别在不同时间点不一致,因此对每个时间点的肿瘤大小分别比较,采用(One-Way ANOVA)。GM锚定组(Anchored GM-CSF)与各对照组比较,肿瘤体积明显减小,具有统计学意义(P<0.05),其余各组之间差别明显(P<0.05)；生存分析表明,X2=22.243,P=0.001,利用Log Rank方法进行检验,实验组相比各对照组,生存时间明显延长,具有显著性差异(P<0.05)。(疫苗治疗功效)肿瘤体积大小检测：经统计软件SPSS17.0重复测量方差分析,F=183.558,P<0.01；时间和肿瘤体积有交互作用,F=104.14,P<0.01。说明各组体积的差别在不同时间点不一致,因此对每个时间点的肿瘤大小分别比较(One-Way ANOVA)。GM锚定组(Anchored GM-CSF)与各对照组比较,肿瘤体积明显减小,具有统计学意义(P<0.05)。GFP锚定组与酒精灭活肿瘤细胞组(Anchored GFP VS Ethanol-fixed)相比较无明显差异(P=0.862),其余各组之间差别明显(P<0.05)。生存期：X2=26.251,P=0.001,实验组相比各对照组,生存时间明显延长,具有显著性差异(P<0.05)。GFP锚定组与酒精灭活肿瘤细胞组(Anchored GFP VS Ethanol-fixed)相比较无明显差异(P=0.455),酒精灭活肿瘤细胞组与单独细胞因子组(Ethanol-fixed VS Soluble GM-CSF)相比较无明显差异(P=0.071),GFP锚定组与单独细胞因子组(Anchored GFP VS Soluble GM-CSF)相比较无明显差异(P=0.245),PBS组与酒精灭活肿瘤细胞组(Ethanol-fixed VS PBS)相比较无明显差异(P=0.145),其余各组之间差别明显(P<0.05)。CTL检测：通过SPSS17.0统计分析软件进行重复测量方差分析表明：各组的脾细胞杀伤毒性实验具有显著性差异,(皮下组)：F=5476.481,P<0.01；(肺组)：F=2071.830,P<0.01。不同效靶比之间细胞杀伤毒性不同,(皮下组)：F=17.398,P<0.01；(肺组)：F=22.522,P<0.01。在此基础上进行多重比较(LSD),(皮下组)：实验组脾细胞对靶细胞的杀伤能力与其余各组相比具有显著性差距(P<0.01),明显高于其余各组,对照组中Soluble GM-CSF杀伤能力最高,PBS组杀伤能力最低,其中Anchored GFP组与Ethanol-fixed组之间没有显著性差别(P>0.05),其余组之间差别明显(P<0.05)；(肺组)：实验组脾细胞对靶细胞的杀伤能力与其余各组相比具有显著性差距(P<0.01),明显高于其余各组,对照组中Soluble GM-CSF杀伤能力最高,PBS组杀伤能力最低,各组之间差别明显(P<0.05)。流式分析检测：利用SPSS17.0统计分析软件分析(One-Way ANOVA)表明：各组见CD4+、CD8+T淋巴细胞的含量及比例具有显著性差异,(皮下组CD4+T淋巴细胞数)：F=795.387,P<0.01,(皮下组CD4+T淋巴细胞比例)：F=611.281,P<0.01,(皮下组CD8+T淋巴细胞数)：F=1040.188,P<0.01,(皮下组CD8+T淋巴细胞比例)：F=281.482,P<0.01；(肺组CD4+T淋巴细胞数)：F=1026.276,P<0.01,(肺组CD4+T淋巴细胞比例)：F=335.042,P<0.01,(肺组CD8+T淋巴细胞数)：F=157.4,P<0.01,(肺组CD8+T淋巴细胞比例)：F=103.515,P<0.01。在此基础上进行多重比较(LSD)表明：皮下或肺实验组小鼠血液中所含有的CD4+、CD8+T淋巴细胞的含量及比例明显高于对照组,具有显著性意义(P<0.05)；对照组中Soluble GM-CSF组小鼠血液中所含有的CD4+、CD8+T淋巴细胞的含量及比例最高,PBS组中的含量及比例最低；皮下组和肺组中Anchored GFP组与Ethanol-fixed组在CD8+T淋巴细胞数方面没有显著性差别(皮下组：P=0.83,肺组：P=0.096),肺组中Anchored GFP组与Ethanol-fixed组在CD8+T淋巴细胞比例方面没有显著性差别(P=0.477)。其余组之间细胞数和量均差别明显(P<0.05)。免疫组化分析检测：并利用SPSS17.0统计分析软件分析(多样本均数比较,单因素方差分析),皮下组：(CD4+T):F=731.131, P<0.01; (CD8+T): F=257.512, P<0.01;肺组：(CD4+T):F=1577.738, P<0.01; (CD8+T):F=453.581, P<0.01。分析结果表明：各组小鼠肿瘤细胞内含有的CD4+、CD8+T淋巴细胞量有明显差异,并在此基础上进行多重比较(LSD),结果证实：皮下、肺组中各组间比较CD4+、CD8+T淋巴细胞量均提示差异明显(P<0.05)免疫记忆肿瘤大小检测：经统计软件SPSS17.0重复测量方差分析,F=1456.074,P<0.01；时间和肿瘤体积有交互作用,F=678.614,P<0.01。说明二者体积的差别在不同时间点不一致,每个时间点的肿瘤大小分别比较(One-Way ANOVA)。GM锚定组(Anchored GM-CSF)与对照组比较,肿瘤体积明显减小,具有统计学意义(P<0.05)。免疫特异性检测：(肿瘤大小)：经SPSS统计分析软件分析(两个重复测量因素的方差分析)证实：F=924.766,P<0.01,时间和肿瘤体积有交互作用,F=191.488,P<0.01。说明二者体积的差别在不同时间点不一致,每个时间点的肿瘤大小分别比较(One-Way ANOVA)。(皮下组、肺组)左、右后腿皮下肿瘤大小区别明显(P<0.05),并且左后腿皮下肿瘤明显大于右后腿,说明经SA-GM-CSF锚定的灭活MB49膀胱肿瘤细胞疫苗治疗后状态良好的小鼠能有效对抗同种肿瘤细胞(MB49膀胱癌细胞)的再次攻击,产生特异性的抗肿瘤免疫反应。(CTL)：通过SPSS17.0统计分析软件进行重复测量方差分析表明：F=3656.951,P<0.01,效靶比和CTL值有交互作用,F=56.613,P<0.01。说明二者CTL值的差别在不同效靶比不一致,每个效靶比的CTL值分别比较(One-Way ANOVA)。实验组小鼠脾细胞对于MB49膀胱癌细胞和RM-1前列腺癌细胞的杀伤能力之间有明显差异(P<0.05),并且对于MB49膀胱癌细胞杀伤能力明显强于RM-1前列腺癌细胞。结论1、我们成功的制备了GM-CSF膜表面修饰MB49膀胱肿瘤细胞疫苗；2、GM-CSF膜表面修饰MB49膀胱肿瘤细胞疫苗保持了良好的GM-CSF生物学活性；3、通过对各组小鼠肿瘤大小、生存期、CTL以及淋巴细胞量的比较,结合GM-CSF本身的特性,我们可以推断本实验通过锚定技术增强了未成熟DCs对MB49膀胱肿瘤细胞的识别,从而强化DCs对肿瘤细胞的吞噬作用以及后期的抗原递呈效率,因此刺激体内产生大量的T淋巴细胞,从而增强机体抗MB49膀胱肿瘤能力,能产生针对MB49膀胱肿瘤细胞的记忆性、特异性免疫作用,有效抑制膀胱转移癌的发生和发展。这种新型锚定疫苗治疗膀胱转移癌的方法,将为今后开展膀胱转移癌的免疫治疗奠定基础。