副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)为革兰氏阴性嗜盐弧菌,不仅是海洋动物的主要病原菌,也是全球因食用海产品引起肠胃炎,甚至败血症的首要原因。该菌的致病性与多种毒力因子相关,其中III型分泌系统(T3SSs)已被揭示为VP的重要毒力因子,其主要通过向宿主细胞分泌毒力蛋白(称为效应蛋白)来破坏宿主细胞的正常功能。T3SS2为2号染色体上的VPaI-7毒力岛基因簇编码,与VP的肠毒性相关。虽然T3SS2效应蛋白已被揭示主要通过破坏宿主肌动蛋白骨架和干扰胞内天然免疫信号通路两种形式诱发肠毒性,但目前仅有少数几个效应蛋白得以研究,需要鉴定新的效应蛋白并揭示其操纵宿主细胞的作用机制。环二鸟苷酸(c-di-GMP,简称cdG)是广泛存在于细菌中的信号分子。近年来的研究发现,病原菌在感染宿主细胞过程中所释放出的cdG可与宿主细胞免疫和炎症反应中重要的信号分子STING蛋白特异性结合,从而激活天然免疫信号通路,激发宿主的免疫防御作用。前期研究结果表明VPA1324为T3SS2的分泌蛋白。本文通过对VPA1324的生物信息学分析,发现VPA1324为含EAL结构域的二鸟苷酸磷酸二酯酶(diguanylate phosphodiesterase);在副溶血弧菌中含有EAL结构域的29个磷酸二酯酶中,VPA1324为唯一由VPaI-7毒力岛基因所编码的蛋白质,为此推测VPA1324可被T3SS2分泌至宿主细胞,通过水解释放至宿主细胞内的cdG来抑制由cdG激活的天然免疫信号通路,进而开展了一系列相关研究。首先构建了与vpa1324基因有关的重组表达载体和基因敲除载体。其次,表达、纯化得到VPA1324,并利用LC-MS/MS技术检测其作用于cdG后的产物,发现VPA1324可以将cdG水解成pGpG和GMP,证实VPA1324具有EAL的二鸟苷酸磷酸二酯酶活性。再次,将表达载体pBBR1MCS2-vpa1324-cyaA(腺苷酸环化酶)转化至T3SS1缺陷菌株POR2,利用胆盐激活T3SS2,在该菌株的分泌蛋白组份中可检测到表达的VPA1324-CyaA偶联蛋白,进一步证实VPA1324为可分泌蛋白;而该菌株感染宿主细胞后,宿主细胞内的环腺苷酸(cAMP)含量显著增加,证实VPA1324依赖T3SS2分泌至真核细胞。然后,将真核表达载体pEGFP-C1-vpa1324转染至宿主细胞,之后转染cdG,结果发现宿主胞内转录因子IRF3下降。上述研究结果初步阐明了VPA1324作为含EAL的二鸟苷酸磷酸二酯酶,通过降解病菌感染时释放至宿主细胞的cdG来抑制由cdG激活的宿主细胞天然免疫通路。这一发现,揭示了效应蛋白抗免疫的全新作用机制,不仅有助于深入理解病原菌的毒力及感染作用机制,也为宿主的信号转导及免疫防御的研究提供全新的策略和模式,对病原微生物学和免疫学领域均具有重要的理论意义和应用价值。