具有抗感染与避孕作用的阴道制剂的研制

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背景与目的:近年来,在现代避孕药具的大家族中,屏障避孕因具有避孕和预防性传播疾病(STD)的双重功能,而为人们所重视。人们提倡的安全性行为运动,即坚持使用避孕套及减少性伙伴数量,在一定意义上可预防STD传播,但文献表明只有安全性行为的范围十分广泛时,才能在全球流行病学上显示其效果。STD和HIV由于传播速度快,治疗费用高,而且会增加其他STD和HIV病例传播机会,日益获得人们的重视,但目前的治疗方法一般人难以负担,而且易产生耐药。药用植物在发达和不发达国家均已有较长的使用历史,为许多在其它的药物系统为顽固和难治的疾病提供了合理的治疗方法。医学植物具有如下优点:副作用少,较少引起耐药,患者耐受性好,相对便宜,趋向于恢复正常的生理功能和纠正潜在的病因,因此逐渐受欢迎。我国具有丰富的中草药资源,利用祖国医学上千年的临床实践优势,运用现代科技,中草药将可发展成为一种安全有效和经济的方法,作为目前STDs和AIDS症状治疗的药物的另一种选择。选取经文献报道具有抗病原体作用的中草药:黄连、黄柏、虎杖、石榴皮、七叶一枝花、连翘、苦参、蛇床子、丁香、仙鹤草、白头翁,进行抗STD病原体活性筛选。采用NP-9作为避孕成分,与经筛选对白色念珠菌、淋球菌、阴道毛滴虫具有抑制或杀伤作用的中草药复方进行组合,研制一种可同时预防感染和避免非意愿妊娠的阴道制剂,试图提供一种可由妇女自行控制的避孕方法。方法:1. 淋球菌、白色念珠菌、阴道毛滴虫的体外分离培养和抗淋球菌、白色念珠菌、阴道毛滴虫中草药的体外筛选。(1) 采用形态学染色、氧化酶试验、生长试验、糖发酵试验对临床标本进行淋球菌体外分离培养。采用形态学染色、厚膜孢子形成试验、芽管试验、碳源利用试验对临床标本进行白色念珠菌体外分离培养;采用显微镜下形态学观察对临床标本进行阴道毛滴虫分离培养。(2) 采用水提醇沉法提取中草药总成分,制备各单味药材醇浸膏。(3) 以抑菌圈为指标,采用平板打孔灌药法进行中草药抑菌实验;以MIC值为指标,采用平板稀释法评价中草药抗菌效力;以滴虫死亡率为指标,评价中草药抗阴道<WP=10>毛滴虫效力。2. 阴道制剂的质量控制(1) 以卡波姆为基质,以中草药复方与N-9为活性成分,制备局部用凝胶。(2) 采用薄层层析法(thin-layer chromatography),用硅胶G薄板,通过铺板、点样、展开剂选择、展开、显色或定位等步骤对单味药材包括黄连、虎杖、丁香进行定性鉴别。(3) 以大黄素为质量控制指标,采用薄层—紫外分光光度法进行含量测定。通过建立标准曲线,加样回收率测定,稳定性实验确立自制凝胶的质量标准。3. 自制凝胶的抗感染与抗生育作用(1) 采用大鼠去势法,通过外源性雌激素建立大鼠假动情模型;阴道接种病原体,建立大鼠阴道混合感染模型。(2) 阴道连续上药一周,以病原体转阴率为指标,评价自制凝胶的抗感染作用。(3) 采用育龄期雌性大鼠,阴道上药后与有生育力雄性大鼠合笼,次晨8:00开始给大鼠作阴道涂片,以发现精子的当天为妊娠第一天,10天后解剖雌鼠,记数生育率、平均活胎数、死胎数和着床点数,评价自制凝胶的抗生育作用。结果: 1. 病原体分离鉴定和抗病原体中草药筛选(1) 病原体分离鉴定:淋球菌呈G-肾形双球菌,血平板和巧克力平板上形成典型菌落,氧化酶试验阳性,分解葡萄糖;白色念珠菌为G+ 酵母样菌,沙氏培养基上形成典型菌落,血清芽管试验阳性,厚膜孢子形成试验阳性。阴道毛滴虫湿片镜检:显微镜(1000倍)下可见到比白细胞大,运动活泼、梨形或水滴状,无色透明的虫体,有鞭毛和波动膜。(2) 抗病原体中草药筛选:黄连抗淋球菌的MIC值为32.50mg/ml,石榴皮抗淋球菌的MIC值为62.50mg/ml,黄柏、丁香、五倍子、黄连+虎杖、黄连+石榴皮、丁香+一枝花抗淋球菌的MIC值为125mg/ml,黄连+一枝花、黄连+丁香、黄连+苦参、黄连+黄柏、石榴皮+一枝花抗淋球菌的MIC值为250mg/ml。黄连、黄连+虎杖、黄连+苦参、虎杖+五倍子、黄连+丁香、黄连+苦参+一枝花、黄连+黄柏+丁香、黄连+丁香+五倍子抗白色念珠菌的MIC值为31.25mg/ml ,黄连+苦参、黄连+七叶一枝花、黄连+五倍子、黄连+虎杖、黄连+苦参+虎杖、黄连+黄柏+一枝花、黄连+虎杖+一枝花、黄连+虎杖+五倍子抗白色念珠菌的MIC值为62.50mg/ml。药物随浓度的递增,抑菌效力增强。白头翁、仙鹤草+白头翁在1:1浓度下作用2h滴虫杀死率达90%,仙鹤草、蛇床子在1:1浓度下作用2h滴虫死亡率达70%。在同一浓度下随着作用时间的延长虫体的死亡率增高,同一时间内药物对虫体的作用随着浓度的增加而增强。<WP=11>2. 制剂的质量控制(1) 分别以各自的对照品和对照药材相比照,检出黄连、虎杖、丁香三味药材。(2) 大黄素在437nm处有最大吸收峰,标准曲线回归方程C=15.3793A+0.3706,r=0.9999,标准曲线在4.0~12.0μg/ ml范围内呈良好线性关系。测得大黄素含量9.89μg /ml~ 11.79μg /ml,加样回收率为97.57%,RSD为1.65%。3. 凝胶组病原体转阴率为87.5%,空白基质组和N-9组未出现病原体转阴。凝胶避孕率为75%,N-9组为87.5%,空白基?
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