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随着全球工业化进程的不断向前推进,塑料制品产量居高不下。邻苯二甲酸酯（Phthalic acid esters,PAEs）作为塑料制品中重要的添加剂,随着塑料制品的大量使用而残留于环境中并引发环境污染。而且,PAEs是一类典型的内分泌干扰物,部分具有致癌、致畸、致突变效应,可通过食物链传递进入人体,危害人体健康。邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是一种常见的PAEs化合物,因其在环境介质中普遍检出,毒性危害严重,被多个国家或组织列为优先控制污染物。因此,如何有效控制和消除环境中的PAEs污染已成为当务之急。目前,微生物降解因成本低廉、有效、无二次污染等特点,已成为PAEs污染修复的重要手段之一。但关于PAEs微生物降解分子机理方面的研究还很薄弱,这在很大程度上影响了降解菌对环境污染修复功能的应用。本文以DBP为目标污染物,选取课题组前期筛选得到的PAEs降解菌Rhodococcus sp.2G为研究对象,通过构建基因组文库筛选克隆获得了DBP水解酶基因,经外源蛋白表达与纯化,研究了DBP水解酶的酶学性质;采用光谱学手段结合分子模拟对接技术,研究DBP与水解酶的结合特性以及水解酶构象的变化,揭示了DBP与水解酶的结合机理。本研究不仅为完整阐述PAEs微生物降解分子机理提供理论基础,还为高效降解工程菌的构建与应用提供基因资源。主要研究结果如下:（1）基因组文库的构建:为获取DBP水解酶基因,构建了降解菌Rhodococcus sp.2G的基因组文库。在所构建的基因组文库中大约产生了18000个转化子,通过三步筛选法获得一个具有DBP降解活性的阳性转化子,将其命名为2G-I。对其重组质粒中插入的基因片段测序与分析得出,该基因片段大小为795 bp,且具有一个ORF,与Rhodococcus sp.2G全基因组测序结果中的α/β-水解酶基因中的ORF相似度高达100%,将其命名为Hyd基因。（2）Hyd基因生物信息学分析:运用生物信息学软件,由Hyd基因推断出Hyd蛋白氨基酸序列,经过蛋白家族和保守结构域查询表明,Hyd蛋白属于α/β-水解酶家族,是α/β-水解酶（CL0028）中的PF00561成员,具有典型的α/β-水解酶超家族结构。此外Hyd蛋白的一级、二级结构预测表明Hyd蛋白是由264个氨基酸组成,分子式为C1289H2015N367O372S6;分子量（M）为28.79 kDa,等电点（pI）5.27;且蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠以及无规则卷曲的含量分别为42.5%,16.67%和41.29%。（3）Hyd基因原核表达与纯化以及酶学性质研究:重组Hyd蛋白在温度为20℃条件下,经0.5 mmol/L IPTG过夜诱导实现了高水平表达,SDS-PAGE分析显示在35 kDa处出现了特异表达的蛋白条带,表达蛋白经纯化和Western Blot验证为诱导表达的特异蛋白。当DBP浓度为27.83 mg/L,0.1 mg Hyd蛋白在5min内对DBP的降解率可达65%;Hyd蛋白最适反应温度为37℃,在20-50℃的温度范围内可有效降解DBP;最适反应pH为7.5,在pH=6.0-8.0内均可有效降解DBP。（4）DBP与Hyd蛋白的作用机制:采用荧光光谱法和分子模拟对接技术测定了DBP与Hyd蛋白的相互作用模式,结果表明:DBP分子嵌插入由Leu29、Ser93、Phe94、Ala97、Pro118、Ile120、Pro123、Ile130、Thr190、Ser191、Trp192等氨基酸残基构成的疏水性空腔之中,通过与Hyd蛋白结合结合形成基态复合物而猝灭Hyd蛋白的内源荧光;DBP不仅与疏水性氨基酸Leu29、Ala97、Ile120、Ile130、Trp192等发生疏水性作用。同时,DBP分子还与Thr190、Ser191形成两个氢键,键长分别为2.0?和2.1?。此外,紫外-可见吸收光谱、同步荧光光谱、圆二色谱分析表明,DBP在与Hyd蛋白结合的过程中,DBP对Hyd蛋白的构象造成影响,导致Hyd蛋白二级结构中的α-螺旋含量降低,表明DBP与Hyd蛋白多肽主链的氨基酸发生结合,引起多肽链的重排和结构变化,多肽链部分伸展导致某些疏水区域被暴露,进而为DBP与Hyd蛋白结合提供反应空间。