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新型紫杉烷类化合物多药耐药逆转活性及机理研究多药耐药(multi-drug resistance,MDR)是导致临床肿瘤化学治疗失败的主要原因之一。耐药的肿瘤细胞往往对多种抗肿瘤药物产生交叉耐药,最终导致肿瘤患者缺乏有效的治疗药物。肿瘤多药耐药机理研究表明,MDR产生的机制非常复杂、且多样,因此,克服肿瘤MDR是目前肿瘤化学治疗的一个难点,极富挑战性。迄今为止,进入临床前期实验的MDR逆转剂,如维拉帕米、环孢素A等存在着体内逆转活性低、毒副作用大等缺点,临床疗效均不理想。因此,开发具有全新结构的新型化合物,寻找广谱、低毒、高效的MDR逆转剂,是目前肿瘤化疗药物研究的一个重要方向。Taxinine是一种非紫杉醇类紫杉烷化合物(Non-Paclitaxel Taxanes),其抗肿瘤活性远远低于紫杉醇,但可以逆转MDR肿瘤细胞对于抗肿瘤药物的耐药性。本所合成室尹大力研究员设计、合成了一系列全新的Taxinine类似物。在以往的研究中,我们经过初步筛选、检测得到了一个细胞毒性低,但对体外多种MDR肿瘤细胞株均具有较强的逆转活性且体内也具有一定活性的化合物Sy1220。研究结果表明,Sy1220逆转肿瘤MDR的作用包括多种机制,如抑制P-gp功能,抑制MDR1、MRP及P-gp表达等。这些结果显示了这类新型肿瘤MDR逆转剂具有低毒、高效的特点,有着良好的开发应用前景。本所生物合成室戴均贵老师以Sinenxan A为原料,通过人工半合成与生物转化相结合的方法,也设计合成了一系列不同类型的紫杉烷类化合物。本课题首先对42种紫杉烷类化合物进行初步筛选,得到了2种逆转活性较高的先导化合物NBP14和NBP36,并进一步深入评价了它们的细胞毒性及其多药耐药逆转活性,并对其多药耐药逆转的可能机制进行了初步探讨。在42种紫杉烷类化合物多药耐药逆转活性的初步筛选实验中,首先用人肺腺癌多药耐药细胞株A549/Taxol作为获得性多药耐药的体外肿瘤细胞模型,筛选得到15种活性较高的化合物,它们分别与紫杉醇联合用药时能够达到或超过Verapamil逆转MDR的作用强度。然后,又以人结肠癌细胞株HCT-8作为内在性多药耐药的体外肿瘤细胞模型,对这15种紫杉烷类化合物进一步筛选,结果得到4种比Verapamil逆转活性更高的化合物,它们分别是NBP13、NBP14、NB20和NBP36。由于NBP13和NBP20与紫杉醇联合用药后能够明显增加紫杉醇对敏感细胞株A549的细胞毒作用,说明其具有一定的细胞毒性,因此进一步研究没有使用这两种化合物,而是以NBP14和NBP36作为进一步研究多药耐药活性及其作用机制的先导化合物。SRB实验结果表明,新型紫杉烷类化合物NBP14和NBP36对多种肿瘤细胞的半数生长抑制浓度(GI50)为10-20μg/ml,其摩尔浓度均大于20μmol/L,远远高于紫杉醇的半数生长抑制浓度(紫杉醇对肿瘤细胞敏感株的GI50值在nmol/L数量级,而对多药耐药肿瘤细胞株在0.1-1μmol/L数量级)。这些结果表明,NBP14和NBP36本身抑制肿瘤细胞生长的作用较弱。尤其是,这两种化合物对于正常人胚胎肺成纤维细胞Helf的半数生长抑制浓度分别为28.20±9.43μg/ml和62.45±15.87μg/ml,说明NBP14和NBP36对正常细胞的细胞毒作用较小。本研究选用7种肿瘤细胞株评价了NBP14和NBP36的体外逆转MDR的活性,包括1个内在性多药耐药的人结肠癌细胞株HCT-8,以及3对获得性多药耐药株与其敏感株:人口腔上皮癌多药耐药细胞KB/V和人口腔上皮癌细胞KB、人肺腺癌细胞多药耐药株A549/Taxol和人肺腺癌细胞株A549、人肝癌耐药细胞株Bel7402/5FU和人肝癌细胞Bel7402。逆转活性研究结果表明,5μmol/L NBP14对内在多药耐药肿瘤细胞模型HCT-8紫杉醇的逆转倍数为81.1,逆转作用超过10μmol/L Verapamil;而10μmol/L NBP14的耐药逆转倍数为186.6,约为同样剂量Verapamil逆转倍数的3倍。10μmol/L NBP36对HCT-8紫杉醇耐药的逆转倍数为88.1,也超过了同样浓度Verapamil对内在性耐药细胞株HCT-8的逆转活性。5μmol/L的NBP14与长春新碱合用时,对获得性耐药细胞模型KB/V的逆转倍数为113.9,接近10μmol/L Verapamil的作用。而10μmol/L NBP14对KB/V的逆转倍数为332.4,约为相同剂量Verapamil逆转活性的3倍。结果表明,10μmol/LNBP36也能够明显增加KB/V细胞对长春新碱的敏感性,其逆转倍数为135.2。结果表明,NBP14和NBP36均呈明显的剂量依赖性地逆转KB/V细胞对长春新碱的耐药性,两种先导化合物10μmol/L时的逆转活性均比相同浓度Verapamil高。7.5μmol/L的NBP14与紫杉醇合用时,对第二种获得性耐药细胞模型A549/Taxol的逆转倍数为138.4,接近10μmol/L Verapamil的作用。而10μmol/LNBP14对A549/Taxol的逆转倍数243.6,约为相同剂量Verapamil的1.5倍。10μmol/L NBP36也能够增加A549/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性,其逆转倍数为119.0,比相同剂量的Verapamil的逆转活性稍低。以上两种获得性耐药细胞模型的实验中,NBP14和NBP36对抗肿瘤药敏感的亲本细胞株均没有明显增强抗肿瘤作用。与对照逆转剂Verapamil类似,10μmol/L NBP14和NBP36对人肝癌细胞株Bel7402及多药耐药株Bel7402/5FU均未显示明显的逆转活性。这表明NBP14和NBP36逆转耐药肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性,具有一定的肿瘤细胞选择模式(pattern),即对某些耐药细胞株有很强的逆转活性,而对另外一些耐药细胞株没有逆转作用。这种逆转肿瘤耐药性的细胞选择模式与对照药Verapamil相似,提示其多药耐药机制也可能相同。采用AO/EB双染色、Hoechst 33258细胞核染色及流式细胞术等技术观察了NBP14单独用药及与紫杉醇联合用药时,诱导细胞凋亡的情况,探讨其逆转紫杉醇耐药作用的机制。实验结果发现,单用10μmol/L NBP14对于多药耐药肿瘤细胞株A549/Taxol,未显示出明显的诱导细胞凋亡的作用;单独应用低于A549/Taxol细胞株的IC50的紫杉醇浓度如100nmol/L时,仅有部分细胞出现凋亡,而两者联合应用后,细胞凋亡的比率明显增加,其效应与单独应用高剂量的紫杉醇类似。同时,10μmol/L NBP14单独应用基本不影响肿瘤细胞的细胞周期,而联合用药后,肿瘤细胞明显出现G2/M期阻滞。这些结果表明,10μmol/LNBP14单独应用无明显的抗肿瘤作用,与低剂量紫杉醇联合应用抗肿瘤作用的基础可能是:NBP14能够明显增加多药耐药肿瘤细胞株对紫杉醇的敏感性。应用微管蛋白间接免疫荧光法及相对提纯的微管蛋白聚合动力学研究以探讨新型紫杉烷类化合物NBP14是否具有抗微管活性。免疫荧光实验结果表明,10μmol/LNBP14单独作用于A549/Taxol细胞24h不影响微管的形态及免疫染色的特性,但分别与紫杉醇和长春新碱合用时,可明显增强这些抗肿瘤药物本身的抗微管作用,即与紫杉醇联合用药时表现为增强其促进微管聚合的作用,而与长春新碱联合用药时表现为增强其促进微管解聚的作用。微管蛋白聚合动力学研究结果也表明,10μmol/L NBP14对微管蛋白的聚合作用无明显的影响。当与紫杉醇联合用药时,微管蛋白聚合动态曲线的线型与单独应用紫杉醇基本一致;而当10μmol/L NBP14与长春新碱联合用药后微管蛋白聚合动态曲线的线型与单独应用长春新碱时基本一致。这些结果说明在无细胞的纯化的微管蛋白的反应体系中,NBP14没有增强紫杉醇促进微管蛋白聚合的作用,也没有增强长春新碱类抑制微管蛋白聚合的作用。结合微管间接免疫荧光实验的结果,我们发现NBP14增强紫杉醇及长春新碱类抗肿瘤作用,依赖于完整功能的细胞结构存在。结合多药耐药逆转活性的结果,我们初步推测NBP14对肿瘤细胞的作用靶点很可能是细胞膜上具有“药泵”功能的各种膜转运蛋白。接着采用Rhodamine123蓄积实验探讨了NBP14对细胞膜上MDR1及MRP1等外排药泵功能的影响。结果表明,NBP14能够剂量依赖性地增加A549/Taxol细胞内Rhodamine123的蓄积。5μmol/L NBP14可使A549/Taxol细胞内Rhodamine123的量接近A549细胞的水平,为不加药时的2.2倍,10μmol/LNBP14使A549/Taxol中Rhodamine123的蓄积量显著增加到不加药时的2.6倍。而NBP14对A549细胞中Rhodamine123的蓄积量没有影响。这一结果提示,NBP14与抗肿瘤药物合用时,可以通过抑制细胞膜上“药泵”外排药物的活性,而增加多药耐药肿瘤细胞内药物的蓄积量,可能是NBP14重要的多药耐药逆转机制之一。应用RT-PCR技术分析了多药耐药肿瘤细胞中常见的4种膜转运蛋白的基因(MDR1、MRP1、BCRP以及LRP)的表达情况,并进一步研究了NBP14对A549/Taxol多药耐药细胞株中MDR1及MRP1基因表达的调节作用。结果表明,HCT-8细胞中4种膜转运蛋白在mRNA水平上均有表达,MDR1及MRP1的表达量更高,可能是其多药耐药的主要机制;KB/V与其敏感株KB细胞相比,4种多药耐药膜转运蛋白中有3种蛋白在转录水平表达增加,依次是MDR1、MRP1和LRP;与敏感株A549相比,A549/Taxol细胞株中有2种膜转运蛋白的mRNA水平明显增高,它们分别是MDR1和MRP1。而MDR1在A549细胞株中几乎没有表达。这两种膜转运蛋白的表达量增加与其多药耐药特性密切相关。NBP14在5μmol/L浓度时,即可以显著降低MDR1基因的转录水平(P<0.05);但在此浓度下没有降低MRP1基因的转录水平(P>0.05)。20μmol/LNBP14即能够显著降低MDR1和MRP1 mRNA表达水平。这些结果表明,NBP14可以在转录水平上降低药泵膜转运蛋白的表达。因此,抑制药泵基因的转录也是NBP14逆转肿瘤细胞多药耐药的重要机理之一。上述结果表明,NBP14药理作用的主要靶点是多药耐药细胞株中高表达的起“药泵”作用的膜转运蛋白MDR1和MRP1。NBP14不仅能抑制这两种基因在转录水平上的表达,同时能够降低P-gp及MRP-1等膜转运蛋白的功能,抑制抗肿瘤药物外排,提高细胞内抗肿瘤药物的浓度。从而逆转多药耐药细胞株对相应的抗肿瘤药物的耐药性。NBP14类化合物是我们所具有自主知识产权的全新结构的紫杉烷类化合物,作为研究中的新型肿瘤多药耐药逆转剂,具有细胞毒性小,逆转活性高等特点,结合其来源丰富,成本较低的优势,具有良好的开发应用前景。中风是导致人类长期严重残疾的主要疾病之一,脑缺血中风发病率占所有中风的87%。临床资料显示,缺血性脑中风患者,只有在脑缺血发生3小时内进行静脉溶栓治疗,才能获得较好的疗效。遗憾的是,许多患者因为各种原因而延长了发病接受治疗的时间,错过了最佳的治疗时机。为了扩大脑中风的治疗窗,医疗科研人员努力寻求新的治疗方式。其中细胞移植治疗发展迅速,这与干细胞研究及应用的飞速发展密切相关。在各种细胞来源中,骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells)由于来源丰富,取材简便,体外培养可以迅速扩增,具有一定的多向分化潜能,可进行自体移植,克服了免疫排斥及伦理学问题,被普遍认为具有良好的实验研究和临床应用前景。研究表明,骨髓基质细胞能够有效地穿过血脑屏障,进入脑实质后定向聚集在损伤脑组织的周围区,并且能够长期存活。在各种脑损伤动物模型,如脑缺血、脑外伤以及脱髓鞘疾病中,骨髓基质细胞移植均能显著改善治疗组的神经功能。但骨髓基质细胞移植治疗的作用机制目前尚无定论。有关的假说主要有2种:干细胞分化与替代假说和神经营养假说。分化假说认为移植到脑组织的骨髓基质细胞能够分化或转分化为各种神经细胞,直接替代受损或死亡的神经细胞。这种假说的前提是骨髓基质细胞完全分化为成熟的神经细胞,精确地整合到缺损的脑组织中,并与周围其它神经细胞建立功能性的联系。但目前的体内实验数据并不充分支持这种假说,尤其缺乏骨髓基质细胞分化为成熟的神经细胞(如有神经电生理活动)的证据。神经营养假说源于骨髓基质细胞在骨髓中的生理作用,分泌大量细胞活性小分子,构建与调节造血干细胞营养、支持及分化的微环境。有趣的是许多研究证实骨髓基质细胞分泌的生物活性小分子的模式能够随着细胞所在的微环境的不同而发生变化。研究表明脑缺血中风中,移植的骨髓基质细胞能够合成与分泌某些有利于损伤修复的神经营养因子与生长因子。本研究的前一部分利用基因芯片技术研究了脑缺血状态下骨髓基质细胞分泌神经营养因子和生长因子的整体情况。首先通过手术建立大鼠大脑中动脉阻塞模型,脑缺血2-3天后,断头剥离缺血边缘区脑组织及正常大鼠相应部位的脑组织,加入无血清培养基制备相应的脑组织条件培养基。骨髓基质细胞在各种条件培养基培养一定时间后,观察细胞形态变化。并通过microarray技术检测骨髓基质细胞中合成神经营养因子与生长因子的情况。然后利用实时定量RT-PCR及荧光免疫组化技术验证microarray的实验结果。结果表明,与血清替代培养基和正常脑组织条件培养基培养的骨髓基质细胞相比,12h培养后,缺血脑组织条件培养基中培养的骨髓基质细胞由扁平的多角形变为细长的纤维状细胞。Microarray实验结果表明,共有44种神经营养及生长因子或其受体相关的基因在3种条件培养基中培养的骨髓基质细胞中均被检测到。与正常脑组织条件培养基相比,缺血脑组织条件培养基中培养的骨髓基质细胞有12个基因表达升高,其中包括7个神经营养因子及生长因子和5个受体基因。实时定量RT-PCR及荧光免疫组化证实这7种神经营养因子及生长因子中,有6种基因在缺血脑组织条件培养基中表达升高。脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、血管内皮生长因子(VEGF)和神经生长因子(NGF)。星形胶质细胞是神经血管单元的重要组分之一,能够为神经元提供结构、营养、代谢等支持作用。脑缺血发生后,星形胶质细胞对受损伤的神经元及血管内皮细胞的生存与修复至关重要。因此,本研究的后一部分,着重研究了缺血脑组织提取液培养骨髓基质细胞48h后收集的条件培养基对原代培养的小鼠星形胶质细胞在缺氧缺糖处理后细胞凋亡、生存、增殖及分泌神经营养因子的影响。同时使用P13K抑制剂LY294002,研究了P13K/Akt信号转导通路在星形胶质细胞损伤修复过程中的作用。结果表明,缺血脑组织条件培养基能够明显减少缺氧缺糖处理后的星形胶质细胞凋亡,增加细胞存活和细胞增殖。实时定量RT-PCR结果表明,脑缺血组织条件培养基能够明显增加缺氧缺糖处理后的星形胶质细胞中脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮细胞生长因子等基因的表达。LY294002抑制实验结果表明,P13K/Akt信号转导通路是星形胶质细胞损伤后修复过程中的重要通路,抑制这一通路中相关蛋白酶的活性能够取消或部分取消脑缺血组织条件培养基对星形胶质细胞的保护作用。以上研究结果均提示,移植到脑组织中的骨髓基质细胞类似于一个能够合成与分泌多种具有生物活性的小分子蛋白的生物工厂。脑缺血发生后,移植的骨髓基质细胞受到缺血微环境诱导,改变分泌模式,明显增加一些神经营养因子及生长因子的合成与分泌。这些因子能够明显减少星形胶质细胞凋亡,增加细胞存活与增殖,同时增加受损伤的星形胶质细胞分泌更多的神经营养因子与生长因子。这些因子又可以通过神经系统内源性修复机制来发挥保护神经元与内皮细胞的作用,从而促进神经功能的恢复。总之,缺血脑组织诱导移植的骨髓基质细胞分泌多种神经营养因子及生长因子可能是治疗作用的启动因素,通过保护脑实质中大量存在的星形胶质细胞而起到增强神经系统内源性修复的作用,这可能是骨髓基质细胞移植治疗作用的重要机制之一。