单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes, LM)是一种重要人畜共患病的病原体,主要污染肉、蛋、奶、水果和蔬菜等。我国单增李斯特菌的检测主要是选用传统培养法,基于快速、准确检测的目的,免疫学与分子生物学检测技术迅速发展。本研究主要依据国家食品安全检测标准GB 4789.30-2010,结合一系列的快速检测技术,如显色培养基、蛋白条检测法、CPA恒温扩增法、实时荧光PCR方法以及全自动微生物分析系统等,完成对样品的进行快速、准确检测。研究中选用单增李斯特菌纯菌以及四种典型的即食食品(肉类、海产品、奶制品以及水果和蔬菜),对国内外常用的四类核酸提取方法(沉降法、磁珠法、离心柱法以及热解法)进行方法比对,选择稳定性好、特异性强的方法作为后期核酸提取的首选方法。研究表明,离心柱法操作简单,稳定性好,灵敏度和特异性高,对实验人员的操作和经验要求不高,易于掌握。利用标准菌株对3种单增李斯特菌快速检测方法的灵敏度、特异性进行比对,然后选取典型即食食品盐水鸭和凉拌菜,通过人工布菌的方法对3种方法进行深入比较研究。结果表明,蛋白条检测法操作简单,但灵敏度低；CPA恒温扩增法克服了蛋白条检测法灵敏度低的不足,不需要大型的检测仪器,适用于基层实验室；实时荧光PCR方法的灵敏度高、特异性好,同时还避免了常规PCR需要进行电泳的过程,减少交叉污染的风险,检测周期短,已经广泛应用于实验条件比较完备的实验室。单增李斯特菌检测中死／活菌的检测是一个难题,排除死菌核酸对检测结果的影响显得极其重要。实验中选用PMA进行死／活菌检测的研究,结果表明在纯培养物中PMA可以较好的排除死菌的干扰,提高检测的准确性,但在基质干扰情况下效果不理想,很容易受到双链非目标基因的影响,造成PMA的大量损耗,影响检测结果。基于以上研究,将核酸提取技术与快速检测方法相结合,建立食品中单增李斯特菌快速检测方法,并通过对大量实际样品检测进行方法的验证与优化。操作步骤：按照GB 4789.30-2010对样品进行前处理和增菌培养,利用单增李斯特菌实时荧光PCR方法对样品增菌液进行快速筛选,阳性结果的增菌液划线培养,结合显色培养基分离、纯化可疑菌落,并通过全自动微生物鉴定系统进行菌落鉴定。结果表明,该方法快速、准确,节省了人力物力,大大提高了工作效率。