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人滋养层细胞表面抗原-2(human trophoblast cell surface antigen 2,TROP2)在许多上皮来源的恶性肿瘤中过表达,参与肿瘤的恶性进展,但在胆囊癌细胞中的增殖、侵袭和转移作用和机制不明。本研究通过临床组织标本、体外细胞及动物体内实验三个层面揭示TROP2调控胆囊癌细胞增殖、侵袭和转移的作用及其可能的机制。研究结果发现,TROP2在胆囊癌组织中高表达,而在癌旁组织中低表达或不表达,在慢性胆囊炎组织中不表达;并且TROP2的表达与是否伴有胆囊结石、肿瘤的不同分化程度、肿瘤浸润与否、淋巴结转移有无及TNM不同分期密切相关(P<0.05),而与年龄、性别和肿瘤大小(3cm为界)无关(P>0.05)。生存分析结果提示,TROP2高表达的胆囊癌病人有着极差生存期(P<0.05),TROP2蛋白的表达是胆囊癌病人预后的独立预测因子。沉默胆囊癌细胞株中TROP2表达,胆囊癌细胞的增殖、侵袭和转移能力明显下降。进一步机制研究发现,沉默TROP2后,一方面上皮间质移位的关键蛋白vimentin表达下降,上皮来源标志性蛋白E-cadherin表达升高;另一方面PI3K/AKT信号通路关键蛋白总的PTEN、p-PTEN和PDK-1表达增加,而p-AKT表达降低。通过上调TROP2的表达,可发现相反的现象。最后,在动物移植瘤模型实验中,我们发现与体外细胞株实验相一致的实验结果,沉默TROP2胆囊癌细胞株的移植瘤体重量更轻,过表达TROP2胆囊癌细胞株的移植瘤体重量更重;TROP2的表达与vimentin、p-AKT表达呈一致,与E-cadherin、总的PTEN表达呈相反趋势。因此,TROP2可能是一种癌基因,通过调控上皮间质转化(EMT)和PI3K/AKT信号通路介导胆囊癌细胞的增殖、侵袭和转移,导致胆囊癌病人的极差预后,这为临床上的靶向干预治疗提供理论依据。第一部分TROP2在胆囊癌组织中的表达及临床意义研究目的:探索TROP2在胆囊癌组织中的表达情况,分析其与临床病理参数之间的关系,并探讨其预后价值。研究方法:取新鲜胆囊癌组织4例,癌旁组织3例及慢性胆囊炎组织3例,运用蛋白印迹法(Western blot)检测TROP2蛋白的表达。取新鲜的胆囊癌及癌旁组织28例,采用Real-time PCR法检测TROP2 mRNA表达情况。搜集第二军医大学附属长征医院2005年至2010年期间确诊并获取病理标本的胆囊癌病人105例,采用免疫组化法检测105例胆囊癌组织和15例癌旁组织中TROP2蛋白的表达,结合病人临床资料和随访数据,采用卡方(χ2)检验分析TROP2蛋白表达与临床病理参数之间的关系;Kaplan-Meier法绘制胆囊癌病人的生存曲线,Cox多因素比例回归模型来评价各个指标的预后意义。结果:Trop2蛋白在新鲜胆囊癌组织中高表达,在癌旁组织中低表达或不表达,在3例慢性胆囊癌组织中均不表达。在28例新鲜胆囊癌组织中,Trop2 mRNA明显高于癌旁组织(P<0.05)。免疫组化结果显示,TROP2蛋白在胆囊癌组织中的阳性表达率分别为61.90%,明显高于癌旁组织中的表达(6.67%),差异具有统计学意义(P<0.05)。TROP2的表达与是否伴有胆囊结石、肿瘤的不同分化程度、肿瘤浸润与否、淋巴结转移有无及TNM不同分期密切相关(P<0.05),而与年龄、性别和肿瘤大小(3cm)无关(P>0.05)。单因素提示肿瘤大小(3cm)、肿瘤分化程度、淋巴结转移与否、TNM分期和TROP2表达与预后密切相关(P<0.05)。Cox多因素生存分析均提示,TNM分期(HR:0.352,95%CI:0.183-0.678,P=0.002)和TROP2表达(HR:0463,95%CI:0.274-0.782,P=0.004)是胆囊癌病人预后的独立因素。结论:从转录和翻译水平均证实TROP2在胆囊癌组织中高表达,在癌旁组织中低表达或不表达。TROP2的表达与是否伴有胆囊结石、肿瘤的不同分化程度、肿瘤浸润与否、淋巴结转移有无及TNM不同分期密切相关(P<0.05),高表达TROP2的胆囊癌病人有着极差生存期,TROP2蛋白的表达是胆囊癌病人预后的独立预测因子。第二部分TROP2对胆囊癌细胞增殖、侵袭和转移的影响研究目的:探讨TROP2对胆囊癌细胞株增殖、侵袭和转移的影响,并观察TROP2对动物体内成瘤重量的影响。研究方法:获得常见胆囊癌细胞株NOZ,GBC-SD,OCUG-1,SGC-996和EH-GB-1,分别采用Western blot和Real-time PCR法检测TROP2的蛋白和mRNA表达。分别建立胆囊癌shRNA-TROP2细胞株和过表达TROP2细胞株GBC-SD和SGC-996,采用MTT分别法检测细胞在第1,2,3,4,5,6,7天的增殖活力,在倒置显微镜下观察细胞克隆能力,运用transwell孔板检测细胞侵袭和转移能力。建立胆囊癌shRNA-TROP2细胞株和过表达TROP2细胞株GBC-SD和SGC-996动物移植瘤裸鼠模型,观察不同分组的瘤体生长情况,并计算瘤体重量。结果:从蛋白水平及mRNA水平分别证实:TROP2在常见胆囊癌细胞株GBC-SD、SGC-996中的表达较EH-GB-1、OCUG-1高,在NOZ表达最低。成功建立胆囊癌细胞株GBC-SD、SGC-996的沉默及过表达细胞株,利用RT-PCR技术检测GBC-SD-Scramble/GBC-SD-shTROP2、SGC-996-Scramble/SGC-996-shTROP2、GBC-SD-Vector/GBC-SD-TROP2、SGC-996-Vector/SGC-996-TROP2中的TROP2表达情况,从mRNA水平证实细胞模型构建成功。沉默TROP2表达的胆囊癌细胞株GBC-SD、SGC-996后,与对照组Scramble相比,细胞增殖能力明显下降,尤其在第5、6、7天明显,差异具有统计学意义(P<0.05);相反,增强TROP2表达的胆囊癌细胞株GBC-SD、SGC-996中,与对照组Vector相比,细胞增殖能力明显增强,尤其在第4、5、6、7天明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。在细胞增殖、克隆、迁移及侵袭能力有类似的现象(P<0.05)。在胆囊癌细胞株GBC-SD、SGC-996及沉默/过表达裸鼠成瘤实验所示,过表达组瘤体重量高于正常对照组,正常对照组瘤体重量高于沉默组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:TROP2的过表达与胆囊癌细胞的增殖、克隆、侵袭和转移的特性有关,体内移植瘤模型也证实过表达TROP2裸鼠的瘤体更重,这可能是胆囊癌恶性程度高,恶性进展的重要原因。第三部分TROP2调控胆囊癌细胞增殖、侵袭和转移的作用机制研究目的:在体内外分别探讨TROP2调控胆囊癌细胞增殖、侵袭和转移的可能机制。研究方法:建立胆囊癌细胞株GBC-SD、SGC-996的沉默及过表达细胞株,采用Western blot法检测上皮间质转化(EMT)关键蛋白vimentin和E-cadherin的表达;检测PI3K/AKT信号通路关键蛋白总的PTEN、p-PTEN、PDK-1、总的AKT和p-AKT的表达。建立胆囊癌细胞株GBC-SD、SGC-996的沉默及过表达细胞株的移植瘤模型,运用免疫组化方法检测EMT关键蛋白vimentin、E-cadherin和PI3K/AKT信号通路关键蛋白总的PTEN、p-AKT的表达。结果:在体外胆囊癌细胞株GBC-SD、SGC-996中沉默TROP2表达后,EMT的标志性蛋白vimentin低表达,E-cadherin高表达;相反,增强TROP2表达后,vimentin高表达,E-cadherin低表达。再者,沉默TROP2表达后,PI3K信号通路中关键分子PTEN高表达,PDK-1高表达,p-AKT低表达;相反,增强TROP2表达后PI3K信号通路中关键分子PTEN低表达,PDK-1低表达,p-AKT高表达。在移植瘤体中,免疫组化结果显示,沉默TROP2表达后,EMT的标志性指标vimentin低表达,E-cadherin高表达,PI3K信号通路中关键分子PTEN高表达,p-AKT低表达;相反,增强TROP2表达后,vimentin高表达,E-cadherin低表达,PI3K信号通路中关键分子PTEN低表达,p-AKT高表达。结论:在体内实验证实,TROP2通过EMT途径和PTEN/AKT信号通路介导胆囊癌细胞的增殖、侵袭和转移,导致胆囊癌恶性进展,这为临床上的靶向干预治疗提供理论依据。