背景:2018年国际癌症研究机构(IARC)公布的全球癌症统计数据显示,乳腺癌在全球女性癌症中的发病率为24.2%,死亡率占15%。在全球范围内,每年将有约210万新诊断的女性乳腺癌病例,占女性癌症病例的四分之一[1]。随着外科手术,化学疗法,内分泌疗法和靶向疗法在内的治疗方法的发展,乳腺癌的治疗已经取得显著进展,其中美国乳腺癌五年生存率达到90.9%,中国乳腺癌五年生存率为82%。即便如此,每年仍有62.7万人死于乳腺癌。肿瘤的复发和转移是导致乳腺癌死亡的主要原因,但与之相关的机制与因素并不明确。因此深入研究乳腺癌发生发展的分子机制,鉴定新的治疗靶点,寻找新的治疗方法仍是乳腺癌研究的重要课题。环状RNA是一类由pre-mRNA经反向剪接形成的且在真核生物中广泛表达的共价闭合环状RNA。环状RNA在生物体内的含量十分丰富,并具有组织特异性和特定的细胞定位,这显示环状RNA受到高度严谨的调控。同时,大量的研究证实,环状RNA通过ceRNA,结合蛋白和自身翻译等多种方式参与肿瘤的发生发展过程,本研究分别送检了 5例乳腺癌转移与非转移新鲜样本进行了环状RNA测序,进而探究环状RNA在乳腺癌发生发展中的作用机制。通常认为,肿瘤细胞线粒体功能异常,会采用无氧糖酵解的方式提供能量,在这种情况下,进入三羧酸循环的丙酮酸减少,会引起多种大分子物质合成障碍。肿瘤细胞通过谷氨酰胺酶和丙酮酸羧化酶两种途径补充三羧酸循环的中间产物,从而保证大分子物质的合成。大量的文献也证实,乳腺癌中丙酮酸羧化酶的表达升高,并与乳腺癌的增殖转移密切相关,本次研究筛选出的环状RNAcirc-FNDC3B与丙酮酸羧化酶直接结合,并影响其活性,可能会为乳腺癌的治疗提供新的思路。方法:1.根据检测到的反向剪接位点(backsplice)数,从乳腺癌转移与非转移组织的芯片中挑选出环状RNA circ-FNDC3B。随后从齐鲁医院收集新鲜的乳腺癌手术切除样本,其中乳腺癌组织60例(发生淋巴结转移36例,未发生淋巴结转移24例),癌旁组织32例,用trizol提取样本总RNA,并通过实时定量PCR技术检测每例样本中环状RNA circ-FNDC3B的表达。2.在MDA-MB-231和MDA-MB-468两种乳腺癌细胞系中过表达或干扰circ-FNDC3B后,通过Transwell小室实验检测circ-FNDC3B对细胞迁移浸润的影响,通过MTS、EdU实验检测circ-FNDC3B对细胞增殖的影响。3.通过RNA核质分离实验,验证circ-FNDC3B的细胞定位。4.构建生物素标记的正,反向circ-FNDC3B的线性RNA,进行RNA-pulldown实验,对RNA-pulldown实验的产物垂直电泳,并进行银染以寻找差异条带,差异条带进行LC-MS/MS分析寻找结合蛋白,使用western blot、RIP实验反向验证circ-FNDC3B与结合蛋白的结合,此外通过设计环状RNAcirc-FNDC3B特异性生物素标记的探针,进行CHIRP实验进一步证实circ-FNDC3B与结合蛋白体内的结合。5.采用westernblot,线粒体蛋白提取,酶活实验验证circ-FNDC3B对结合分子的表达,定位及活性的影响。6.通过qPCR检测RNA结合蛋白对circ-FNDC3B表达的影响。结果:1.通过实时定量PCR技术对60例乳腺癌组织,32例正常乳腺组织中circ-FNDC3B的表达量进行检测发现,与正常乳腺组织相比,circ-FNDC3B在乳腺癌组织中表达降低,且在淋巴结转移的乳腺癌患者中表达水平低于非淋巴结转移患者。2.在MDA-MB-231和MDA-MB-468两种乳腺癌细胞系中过表达circ-FNDC3B,乳腺癌细胞的增殖,迁移和浸润能力明显减弱;干扰circ-FNDC3B的表达,促进细胞的增殖,迁移和浸润。3.RNA核质分离实验证实,circ-FNDC3B主要定位于胞质。4.RNA-pulldown、LC-MS/MS、western blot、RIP、CHIRP 等实验证实 circ-FNDC3B可以与丙酮酸羧化酶特异性结合。5.western blot实验证实改变circ-FNDC3B的表达并不影响丙酮酸羧化酶的表达及线粒体定位,体外酶活实验证实过表达circ-FNDC3B,可以抑制丙酮酸羧化酶的活性。6.circ-FNDC3B表达受到RNA结合蛋白ESRP1的调控。结论:环状RNA circ-FNDC3B在乳腺癌样本中表达降低。circ-FNDC3B抑制乳腺癌细胞的迁移、浸润与增殖能力。详细的调控机制是circ-FNDC3B结合并抑制丙酮酸羧化酶的活性,由于丙酮酸羧化酶可以改变氨基酸代谢进而抑制多种生物大分子的合成和胶原蛋白羟基化,而乳腺癌的代谢依赖丙酮酸羧化酶的活性,因此环状RNAcirc-FNDC3B通过抑制丙酮酸羧化酶的活性进而抑制乳腺癌的迁移、浸润和增殖能力。