【摘 要】
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近年来黄原胶低聚糖正逐渐引起人们的注意,其具有优良的抗氧化性能,能够治疗骨关节炎、抑制细胞凋亡等。然而由于黄原胶降解方法和糖纯化手段的制约,高纯度的低聚糖单体制备困难,限制了黄原胶低聚糖活性机理的探究以及工业化的应用,因此制备高纯度黄原胶低聚糖的单体十分必要。考虑到黄原胶主链具有类纤维素结构,本研究将黄原胶侧链结合模块CBM6B融合在纤维二糖水解酶催化结构域Cel48S-CD上构建了新型纤维二糖水
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近年来黄原胶低聚糖正逐渐引起人们的注意,其具有优良的抗氧化性能,能够治疗骨关节炎、抑制细胞凋亡等。然而由于黄原胶降解方法和糖纯化手段的制约,高纯度的低聚糖单体制备困难,限制了黄原胶低聚糖活性机理的探究以及工业化的应用,因此制备高纯度黄原胶低聚糖的单体十分必要。考虑到黄原胶主链具有类纤维素结构,本研究将黄原胶侧链结合模块CBM6B融合在纤维二糖水解酶催化结构域Cel48S-CD上构建了新型纤维二糖水解酶Cel48S-CD-CBM6B,以期特异性识别黄原胶侧链并规律性切割黄原胶主链以制备高纯度的黄原胶寡糖。酶学性质分析结果表明,以黄原胶为底物时,Cel48S-CD与Cel48S-CD-CBM6B的最适p H分别为6.0与8.0,p H稳定区间为5.0-6.0以及7.0-8.0,这说明CBM6B显著影响了纤维二糖水解酶的最适p H与p H稳定区间。而CBM6B并未改变纤维二糖水解酶的最适温度和热稳定性。在最适条件下测定两种重组酶对黄原胶的酶活,结果显示Cel48S-CD-CBM6B的酶活是Cel48S-CD的4.5倍（分别为1241.12±65.69 U/g,273.91±30.91 U/g）,这说明CBM6B能够有效辅助酶催化结构域特异性识别黄原胶并提高其酶活。通过X射线衍射、红外光谱以及凝胶色谱分析了Cel48S-CD与Cel48S-CD-CBM6B作用黄原胶后水解产物的结构及分子量,发现两种酶均可以降解黄原胶。随后应用离子色谱表征了黄原胶水解产物的聚合度,显示出Cel48S-CD-CBM6B的水解产物中含有高纯度的三糖,而Cel48S-CD的产物中仅含有少量的四糖,这说明新型纤维二糖水解酶降解黄原胶的能力更强并获得更多的寡糖。此外本研究还探究了离子液体[Bmim]Cl对纤维二糖水解酶降解黄原胶的影响。原子力显微镜结果证明了[Bmim]Cl可以破坏黄原胶的氢键网络从而使其无序化。酶活测定结果显示[Bmim]Cl辅助两种纤维二糖水解酶降解黄原胶的最优浓度为1%（v/v）,但Cel48S-CD与Cel48S-CD-CBM6B对[Bmim]Cl的耐受能力不同,分别为10%（v/v）与1%（v/v）,这说明在[Bmim]Cl存在的环境中Cel48S-CD具有更强的稳定性。随后应用[Bmim]Cl与纤维二糖水解酶共同作用黄原胶,产物的离子色谱表征结果可知[Bmim]Cl使黄原胶无序化后使更多可作用位点暴露出来进而获得了更多高纯度三糖与四糖产物,同时推测这两种寡糖可能由纤维三糖与纤维四糖或是三糖与四糖结构单元构成。以上实验说明了CBM6B与[Bmim]Cl在降解黄原胶的过程中均具有增益效果。本研究为今后高纯度的黄原胶寡糖的制备提供了理论基础与研究策略,进而对功能性黄原胶寡糖的工业化生产具有重要意义。
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