研究背景椎间盘退行性变是导致脊柱解剖结构与功能紊乱性疾患的根本原因。随着生活节律与社会老龄化进程的加快,与椎间盘退变相关的脊柱疾病(椎间盘突出症、退变性椎管狭窄、退变性脊柱滑脱及不稳、退变性侧弯等)的发病率越来越高。虽然国内外学者针对与椎间盘退变有关因素如金属基质蛋白酶、蛋白多糖酶、弹性蛋白酶、炎症介质、细胞因子、自身免疫反应、一氧化氮及遗传因素等进行了一系列的研究,对其发生、发展有了一定的认识,但对退变的根本原因知之甚少。为了深入研究椎间盘退变的病理生理机制,探讨其发生与发展的根本原因,我们前期应用蛋白质组学方法,对正常及退变的椎间盘髓核组织进行双向电泳及质谱分析,结果发现在退变的髓核组织中过氧化物还原酶Ⅱ(PeroxiredoxinⅡ, PrxⅡ)存在着显著的差异表达,但该酶在椎间盘退变中的作用及其作用机理不明。PrxⅡ是过氧化物还原酶Peroxiredoxins (Prxs)家族成员之一,是新近发现相对分子质量在20～30×103的蛋白。Prxs的功能多样,具有抗氧化、调节细胞内信号转导、参与细胞周期进程和发挥分子伴侣等功能。抗氧化作用是其最主要的功能,H202是Prxs主要反应底物之一,细胞利用Prxs清除有害的H202以达到保护细胞免受损伤的目的。然而近年来H202作为信号转导的第二信使越来越受到重视,因而作为H202重要调节物的Prxs亦成为研究热点,虽然既往的大多研究都着重于Prxs对细胞的保护作用,参与细胞信号转导、细胞分化、抗氧化等。但近年来一些研究发现其功能不仅仅局限于此。髓核细胞作为生物体中的一种特殊类型的细胞,在退变的髓核中发现PrxⅡ,到底PrxⅡ发挥何种作用?在椎间盘退变中扮演何种角色呢?文章旨在通过体外培养椎间盘髓核细胞,于细胞中加入PrxⅡ,观察其对退变的髓核细胞的影响,探讨其在椎间盘退变中的作用。目的通过体外培养原代及传代退变椎间盘髓核细胞,在传二代髓核细胞中加入不同浓度的过氧化物酶Ⅱ,倒置显微镜下观察髓核细胞形态变化,cck-8试剂盒检测细胞活性变化,用夹心抗体ELISA检测Ⅱ型胶原合成的改变,探讨PrxⅡ在椎间盘退变过程中的作用。方法本试验分三部分进行,第一：髓核组织的获得,原代髓核细胞的培养、鉴定及传代。第二部分：试验用传二代细胞,设立对照组及实验组,对照组为不加Prx-Ⅱ,实验组中分别加入不同浓度的Prx-Ⅱ(10ng/mL、100ng/mL、1000 ng/mL),于1、3、5、7天观察各组中细胞形态变化、cck-8试剂盒检测细胞活性；第三部分：试验用传二代细胞,设立对照组及实验组,对照组为不加Prx-Ⅱ,实验组中加入不同浓度Prx-Ⅱ(10ng/mL、100ng/mL、1000 ng/mL)后于3、7天取对照组及实验组上清,采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)测定Ⅱ型胶原表达情况。结果1、在倒置显微镜下连续观察,原代髓核细胞于6-7天贴壁,细胞多为梭形,有伪足伸出；经胰酶消化传代后,细胞贴壁生长速度加快,于7天后达到生长高峰,以后细胞生长减缓。细胞传至第4代后细胞明显萎缩,凋亡增加。而加入PrxlⅡ组椎间盘细胞生长减缓,生长周期缩短。2、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色胞质及核内呈现黄染的颗粒状阳性结果,证实为髓核细胞,实验组较对照组染色明显变浅。3、cck-8法测定椎间盘髓核细胞吸光度(OD)值经过析因方差分析检验F=213.780,P=0.000,说明五组之间比较差异具有显著性。相同时间点不同组之间两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05)；同一组之间不同时间点之间比较差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。4、采用双抗体ELSA试验测得第3天及第7天Ⅱ型胶原蛋白OD值,经计算得出Ⅱ型胶原蛋白的浓度,采用析因方差分析得出F=126.340,P=0.000。说明实验组与对照组之间有显著性差异((P<0.05)；采用单因素方差分析得出：第7天不同组间两两比较差异具有统计学意义(P<0.05),第3天,对照组与实验组之间有差异,但10ng/ml组与100ng/ml组间比较差异无显统计学意义,可能操作等因误差引起；同一组之间不同时间点之间用t检验差异亦具有统计学意义(P<0.05),说明随着时间的延长,细胞凋亡加重。PrxⅡ能降低细胞的增殖活性,细胞基质的合成,并且在有一定浓度范围内呈剂量效应关。结论本实验为椎间盘髓核细胞的培养提供了简单、有效的方法,体外培养的人退变腰椎间盘髓核细胞,加入过氧化物酶后,椎间盘髓核细胞数量减少,活力降低,髓核细胞合成Ⅱ型胶原的量减少,且随着PrxⅡ浓度的增加,髓核细胞活力、胶原的合成能力亦受到明显抑制。该试验提示过氧化物酶Ⅱ对椎间盘髓核细胞的活性、Ⅱ型胶原合成有明显的抑制作用,并呈剂量依赖关系。以此推测PrxⅡ对髓核细胞的抑制作用可能是导致椎间盘退变的一种促进因素。