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轮状病毒（Rotavirus,RV）是婴幼儿和幼龄动物腹泻的主要病因,其所编码的非结构蛋白NSP4,功能之一是作为肠毒素引发腹泻,严重威胁着婴幼儿健康和养殖业。据报道,在RV感染过程中,整联蛋白α2β1作为RV的主要受体之一,涉及NSP4的表达及NSP4与细胞内钙离子、整联蛋白受体和相关酶的相互作用;已知益生菌及其培养上清能抑制RV感染,但是是否和如何通过NSP4发挥作用,有待近一步研究。据此,本研究运用食淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus,L.A）及其培养上清,先后完成了食淀粉乳杆菌及其培养上清体内外抗RV能力分析;重组猪轮状病毒NSP4蛋白的表达、鉴定以及NSP4重组蛋白的免疫原性测定;体内外抗RV对细胞和空肠组织内NSP4、钙离子、磷脂酶C、Dicer和整联蛋白α2β1的检测,探讨其对NSP4表达的部分调节机制,阐释其在抗猪轮状病毒（Procine Rotavirus,PoRV）中的效应。为阐明益生菌与培养上清在抗RV作用的异同,该研究分为两部分,体外的细胞实验和体内的动物实验。体外实验中使用IPEC-J2细胞为平台,以A组猪轮状病毒OSU株为作用因子,体内实验则选择BALB/c三日龄乳鼠为实验动物。用CCK8检测法,分析食淀粉乳杆菌培养上清体外抗RV能力;通过PCR、SDS-PAGE、Western-blot等方法制备的NSP4多克隆抗体完成间接免疫荧光检测;采用实时荧光定量PCR（qPCR）、比色分析法、ELISA等方法检测细胞和空肠组织内NSP4、钙离子、磷脂酶C、Dicer和整联蛋白α2β1的变化和上述效应的关系。体外实验分6组:正常组（Normal group）、食淀粉乳杆菌培养上清短期预处理细胞组（Short-term pretreatment cell of L.A culture supernatant group,ST group）、食淀粉乳杆菌培养上清长期预处理细胞组（Long-term pretreatment cell of L.A culture supernatant group,LT group）、病毒组（RV group）、食淀粉乳杆菌培养上清短期预处理细胞抗病毒组（Short-term pretreatment cell of L.A culture supernatant antiviral group,STV group）和食淀粉乳杆菌培养上清长期预处理细胞抗病毒组（Long-term pretreatment cell of L.A culture supernatant antiviral group,LTV group）,分别在食淀粉乳杆菌培养上清短长期预处理细胞后和感染RV后的12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h时对各检测因子进行测定。体内实验分4组:正常组（Normal group）、病毒组（RV group）、先灌胃益生菌后感染病毒组（Gavaged probiotic before inoculation group,BI group）、先感染病毒后灌胃益生菌组（Gavaged probiotic after inoculation group,AI group）,共饲喂11 d。从第1 d起,BI组每只每天灌胃给予50μL食淀粉乳杆菌活菌液（106 cfu/mL）,其他组每只每天灌胃等量PBS。RV组、BI组和AI组在4 d时每只饲喂毒力为10-6.0836.083 TCID50/0.1mL RV 50μL,在AI组中,从第4 d开始每只每天灌胃50μL食淀粉乳杆菌活菌液（106 cfu/mL）。在2 d、3 d、4 d（感染病毒前1 h）、5 d、7 d、9 d、11 d取各组空肠组织,BI组感染病毒前取的空肠组织即为食淀粉组（Immune group）。研究结果显示,用食淀粉乳杆菌培养上清最大无毒剂量预处理细胞具有较良好的抗RV效果,据此,分别筛选出食淀粉乳杆菌培养上清短期预处理细胞2 h抗病毒最强组和食淀粉乳杆菌培养上清长期预处理细胞8 h抗病毒最强组,它们同样具有较好的抗RV效果并应用于后续实验;选择制备的NSP4多克隆抗体,在间接免疫荧光实验中也发现,食淀粉乳杆菌培养上清短长期预处理细胞均能抑制RV感染,且食淀粉乳杆菌培养上清短期预处理细胞抗RV效果优于长期;实验发现,食淀粉乳杆菌在乳鼠感染RV中促进动物体重增长并起到减少病毒量的效果。体外实验检测发现,感染病毒后各时间点,STV组和LTV组NSP4 mRNA相对表达水平均低于RV组;除72 h外,RV组、STV组和LTV组细胞中钙含量显著高于正常组（P<0.05）,在各时间点STV组和LTV组细胞中钙含量均低于RV组;RV组细胞内磷脂酶C含量显著高于正常组、STV组和LTV组（P<0.05）;RV组整联蛋白α2β1含量显著高于正常组（P<0.05）,STV组和LTV组整联蛋白α2β1含量均低于RV组;RV组细胞内Dicer含量显著高于正常组、STV组和LTV组（P<0.05）。体内实验检测结果显示,感染病毒后各时间点,BI组和AI组NSP4mRNA相对表达水平均低于RV组;除11 d外,各时间点RV组组织中钙含量高于正常组、BI组和AI组;除7 d AI组外,各时间点各组磷脂酶C含量均高于正常组,各时间点BI组和AI组磷脂酶C含量低于RV组;RV组整联蛋白α2β1含量显著高于正常组（P<0.05）,BI组和AI组整联蛋白α2β1含量均低于RV组;RV组Dicer含量显著高于正常组（P<0.05）,BI组和AI组Dicer含量均低于RV。以上说明食淀粉乳杆菌及其培养上清均能通过抑制NSP4的mRNA相对表达量从而抑制NSP4蛋白合成达到抗RV效应,它还可以降低病毒感染后细胞和空肠组织中的钙离子、相关酶和受体整联蛋白α2β1的含量。总之,发现食淀粉乳杆菌及其培养上清能有效的抑制RV感染;食淀粉乳杆菌及其培养上清能抑制IPEC-J2细胞和乳鼠空肠组织在RV感染后NSP4蛋白的表达,并显著减少细胞和空肠组织内钙离子及抑制受体整联蛋白α2β1的合成,而且降低细胞和空肠组织内磷脂酶C和Dicer的含量。并初步提示食淀粉乳杆菌及其培养上清不仅能抑制NSP4的表达,也可能通过抑制NSP4的表达量进而对细胞和组织内的钙离子、磷脂酶C、Dicer以及受体整联蛋白α2β1的含量产生干扰效应。