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[背景与目的]
内毒素休克等重症感染性疾病的发病过程中，由于多种因素的作用，患者会发生绝对或相对肾上腺功能不全，导致临床抢救成功率下降。TNF-α是一种重要的前炎症介质，是内毒素休克等重症疾病发生发展过程中主要的炎症介质，可作用于下丘脑—垂体—肾上腺轴（HPA轴）的各个环节，影响肾上腺皮质的功能。本课题组通过检测TNF-α对小鼠肾上腺皮质Y1细胞凋亡以及皮质醇合成的影响，应用RT-PCR和免疫细胞化学方法观察Y1细胞的TNF受体亚型的分布;应用小RNA干扰法下调Y1细胞中阳性表达的TNF受体，探讨TNF-α对干扰后Y1细胞凋亡以及皮质醇合成的影响;从而明确小鼠肾上腺皮质Y1细胞表面是否存在TNF-α受体，存在何种受体，以及TNF-α对Y1细胞的作用是否通过该受体发挥作用;初步探讨TNF-α对Y1细胞凋亡和皮质醇合成影响及其作用机理。研究结果可为临床内毒素休克等重症感染性疾病的救治提供一定的实验依据和理论基础。
[方法]
1、应用流式细胞仪检测TNF-α在不同剂量、不同作用时间对Y1细胞凋亡的影响，同时应用酶标法检测Caspase8和Caspase3的变化，探讨其对细胞凋亡通路的影响;
2、应用放免法检测一定浓度的TNF-α或/和ACTH作用Y1细胞不同时间后对皮质醇合成的影响;
3、应用RT-PCR检测一定浓度的TNF-α或/和ACTH作用Y1细胞不同时间后对皮质醇合成限速酶---类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)表达的影响;
4、应用RT-PCR和免疫细胞化学技术在mRNA和蛋白水平检测Y1细胞表面TNF受体类型;
5、小RNA干扰法下调Y1细胞中阳性表达的TNF受体，qPCR法和Western Blot法检测干扰效果;
6、应用流式细胞仪检测TNF-α在不同剂量、不同作用时间对TNFR-miRNA-Y1细胞凋亡的影响，同时应用酶标法检测Caspase8和Caspase3的变化，观察其在剂量、时间上对凋亡通路的影响;
7、应用放免法检测一定浓度的TNF-α或/和ACTH作用TNFR-miRNA-Y1细胞不同时间后对其皮质醇合成的影响。
[结果]
1、Y1细胞在100～250U/ml的TNF-α作用不同时间后，细胞凋亡率明显增加(P＜0.05)，同时Caspase8和Caspase3的表达增强，呈剂量、时间依赖性(P＜0.05）;
2、TNF-α单独作用对Y1细胞皮质醇合成的抑制不明显(P＞0.05)，ACTH可明显促进Y1细胞皮质醇的合成(P＜0.05)，TNF-α与ACTH共同作用后，可明显抑制Y1细胞由于ACTH介导的皮质醇合成的增加(P＜0.05);
3、RT-PCR结果显示:TNF-α单独作用对Y1细胞的StAR抑制作用不显著（P＞0.05），ACTH单独作用后StAR表达显著上升(P＜0.05）。而TNF-α和ACTH共同作用Y1细胞StAR的表达受到抑制(P＜0.05);
4、RT-PCR和免疫细胞化学结果显示:Y1细胞TNFR1mRNA和蛋白表达阳性，TNFR2mRNA和蛋白表达阴性;
5、检测小RNA抑制TNFR1后的TNFR-miRNA-Y1细胞干扰效率为71.74％，WesternBlot显示TNFR-miRNA-Y1细胞TNFR1表达水平明显下降;
6、TNF-α对TNFR-miRNA-Y1细胞凋亡无明显促进作用(P＞0.05)，对Caspase8/3活性也无明显影响(P＞0.05);
7、放免结果显示:ACTH可明显促进TNFR-miRNA-Y1细胞皮质醇的合成(P＞0.05)，TNF-α与ACTH共同作用后，对TNFR-miRNA-Y1细胞ACTH介导的皮质醇合成的无明显影响(P＞0.05)。
[结论]
1、TNF-α能够诱导Y1细胞的凋亡，并呈剂量时间依赖关系;这种凋亡诱导作用可能是通过激活Caspase8和Caspase3通路实现的;
2、TNF-α单独作用对Y1细胞的皮质醇合成和StAR的影响不显著;ACTH单独作用能够促进Y1细胞皮质醇的合成和StAR的表达;TNF-α与ACTH共同作用可能通过下调StAR的表达而抑制Y1细胞ACTH介导的皮质醇的合成;
3、从蛋白、mRNA水平证实，Y1细胞以表达TNFR1为主;
4、TNF-α对干扰后的TNFR-miRNA-Y1细胞凋亡及凋亡相关激酶Caspase8和Caspase3无明显影响;同时TNF-α与ACTH共同作用对TNFR-miRNA-Y1细胞的皮质醇的合成影响不显著，提示TNF-α对Y1细胞的作用是通过TNFR1介导而实现的。