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功能核酸(Functional Nucleic Acids)由于具有丰富的多样性和良好的生物功能,已作为一种常见的分子工具广泛应用于化学、生物学、生物医药科学以及纳米技术等研究领域。通过策略性的化学修饰,功能核酸能够极大地满足各种典型的实验需求并投入到更广泛的实际应用中。同时,发展更加经济、高效的SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术将为体外人工完成功能核酸的筛选与进化提供强有力的保证。 基于以上两方面,本论文从功能核酸的骨架修饰(Backbone modification)与筛选技术创新两个角度展开研究。 一、利用骨架修饰提高G-四聚体DNAzyme的催化活性。 本文在第二章以G-四聚体过氧化物模拟脱氧核酶(Peroxidase MimickingDNAzyme)为模型,考察了四种骨架修饰(L-型DNA、硫代修饰、2’-氧-甲基修饰以及锁核酸修饰)对G-四聚体DNAzyme的过氧化物酶催化活性、结构、热稳定性以及G-四聚体与Hemin之间的亲和力的影响。G-四聚体DNAzyme具有催化底物显色或化学发光的功能,近年来在生物医学研究及检测领域显示独特的应用优势。因此,找到更加稳定、催化活性更高的G-四聚体DNAzyme无疑具有重大的意义。本文的研究结果表明,骨架修饰会影响G-四聚体DNAzyme的拓扑结构,进而改变其催化活性。更重要的是,本研究发现2’-氧-甲基修饰能够起到促进平行G-四聚体结构形成的作用,并且极大地提高G-四聚体DNAzyme的过氧化物酶催化活性和热稳定性,该发现为今后开发高稳定性、高活性的人工过氧化物模拟核酸酶提供展新的思路。 二、BEAMing表面展示技术用于核酸适配体的筛选。 本文在第三章建立了以BEAMing表面展示技术为基础的核酸适配体筛选新方法。传统的SELEX(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment)技术需要经过漫长的8-20轮的筛选才可获得核酸适配体,筛选操作冗长费力,同时后续克隆测序也繁琐复杂。另外,常规的PCR(Polymerase ChainReaction)过程容易产生扩增歧视(PCR bias)和非特异性扩增条带,严重干扰筛选的顺利进行。基于液滴PCR(Emulsion PCR)的BEAMing技术(Beads,Emulsion,Amplification,Magnetic)不但具有通量高、制备简便、样品需求少、无扩增歧视等优点,而且能通过将每个液滴中的PCR产物回收在相应的微球表面上,使每条核酸序列的结构与功能特性独立显现,从而实现核酸序列的单克隆展示。本章建立的方法利用偶联有PCR正向引物的琼脂糖微珠在油包水液滴中进行单分子模板水平的BEAMing PCR,使寡核苷酸库以单克隆的形式展示在微球表面,并通过核酸展示微球与过表达EpCAM蛋白(Epithelial Cell AdhesionMolecule,上皮细胞粘附因子)的人胃癌细胞KATOⅢ的亲和作用,成功获得能够高亲和力结合EpCAM蛋白的核酸适配体,该法能够避免传统筛选方法中对富集寡核苷酸库进行繁琐的克隆测序步骤。该BEAMing表面展示技术为今后更加准确、高效、经济地获得功能核酸开辟了捷径。