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赭曲霉毒素A(OTA)是由曲霉属(Penicillium)和青霉属(Aspergillus)真菌中的几个种产生的一种次生代谢产物,其化学本质为苯甲酸异香豆素,是由L-β-苯丙氨酸和7-羧-5-氯-8-羟-3,4-二氢-R-甲基异香豆素通过肽键连接而成的衍生物。OTA的主要靶器官是肾脏,同时研究证实它也具有很强的免疫毒性。OTA等霉菌毒素对动物机体免疫系统的损伤可能是猪场疫苗免疫效力低的一个重要原因。但目前为止国内外对OTA毒性的研究主要仍集中在其肾毒性与致癌性,OTA对猪免疫细胞的毒性作用还鲜有报道。猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是目前已知的最小的动物病毒之一,无囊膜,病毒颗粒的平均直径约17nm,基因组为环状单链DNA。PCV2感染可能会引起一系列的临床综合征,人们将这类疾病统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD),包括断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪增生性与坏死性肺炎(PNP)等。单核/巨噬细胞(包括肺泡巨噬细胞)被认为是PCV2最主要的靶细胞,因此PCV2感染对免疫系统的损伤最为严重。在国内猪场,OTA污染水平和PCV2感染率都很高,因此很高比例的猪场中可能存在OTA污染和PCV2感染同时发生的情况。但目前为止,OTA和PCV2免疫毒性的相互影响及其机制还从未有人做过研究。本课题的目的正是以猪肺泡巨噬细胞系3D4/21为体外细胞模型来研究OTA诱导的免疫毒性作用,并探讨OTA和PCV2共存时PCV2对OTA诱导的免疫毒性的影响及其内在机理,为OTA中毒和PCV2感染在生产实践中的联合防治提供理论依据。试验一:OTA对猪肺泡巨噬细胞的免疫毒性及机理研究我们选择猪肺泡巨噬细胞系3D4/21作为细胞模型,用浓度为0,0.1,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0μg/mL的OTA处理细胞。结果显示,和对照组相比,1.5-4.0 μg/mL的OTA显著降低了细胞活力,1.0-4.0μg/mL的OTA显著升高了细胞培养液中的乳酸脱氩酶(LDH)的活性,并呈剂量依赖效应。细胞凋亡的检测相对更敏感,OTA在0.5μg/mL时显著提高了细胞的凋亡水平(25.8%),显著降低了 Bcl-2/Bax mRNA的比值(16.9%)。另外,0.5 μg/mL的OTA显著提高了白介素-1α(IL-1α)的mRNA水平(29.1%),1.0μg/mL的OTA显著提高了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA水平(68.3%),但并非剂量依赖,OTA浓度达到2.0μg/mL时IL-1α和TNF-α的表达出现了轻微降低。同时,0.5μg/mL的OTA显著提高了细胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平(分别提高43.7%和20.5%),1.0μg/mL的OTA显著降低了总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性(19.8%)。N-乙酰半胱氨酸(NAC)显著减轻了 OTA诱导的细胞活力下降、LDH活性上升、凋亡水平升高及氧化应激相关指标的改变。这些结果表明OTA诱导了 3D4/21的免疫毒性并且是由细胞的氧化应激介导的。试验二:PCV2感染对OTA诱导的猪肺泡巨噬细胞免疫毒性的影响及机理研究我们选择猪肺泡巨噬细胞系3D4/21作为细胞模型,设置平行的PCV2感染组和未感染组,用浓度为0,0.1,0.5,1.0,1.5,2.0μg/mL的OTA处理细胞。结果显示,在OTA浓度为1.0-2.0 μg/mL时,PCV2感染加重了 OTA诱导的细胞活力降低和LDH活性升高,并且使产生细胞毒性的最小OTA浓度下降了。另外,在1.0-2.0 μg/mL的OTA下PCV2感染加重了 OTA诱导的细胞凋亡;所有浓度的OTA下PCV2感染都会加重OTA诱导的促炎性细胞因子IL-1α和TNF-α的表达以及ROS水平的升高。同时,在1.5μg/mL的OTA下PCV2感染加剧了 OTA诱导的TLR4和MyD88的mRNA(分别提高101.9%和22.6%)和蛋白水平(分别提高51.4%和79.2%)的升高,也加剧了 OTA诱导的ERK1/2、p38、NF-KBp65等下游信号蛋白的磷酸化(分别提高58.1%、72.0%和97.3%)。进一步研究表明,用TLR4特异性siRNA干扰沉默TLR4基因,可以显著减轻PCV2感染对OTA诱导的免疫毒性的增强作用,表现在提高细胞活力(17.6%)、降低LDH活性(15.7%)、降低细胞凋亡水平(23.2%)、降低IL-1α(26.4%)和TNF-α(23.8%)的表达上。以上结果说明PCV2感染可以加重OTA诱导的对3D4/21的免疫毒性作用,并且激活TLR4/MyD88信号通路是其主要机制之一。