论文部分内容阅读
研究背景及意义银配合物已经被研究证明具有抗菌、抗肿瘤特性。单质子化的脱氢脱甲基斑螯酸银配聚物(Ag-SP-DNC)是我们合作课题组在前期的实验研究中新合成的银配聚物。在这项研究中,我们得到的实验结果表明Ag-SP-DNC是通过活性氧(ROS)介导的线粒体依赖性细胞凋亡通路导致肺癌细胞发生凋亡。Ag-SP-DNC对人非小细胞肺癌细胞A549有生长抑制作用,将细胞周期抑制于G2/M期,导致细胞发生凋亡。Ag-SP-DNC引起细胞发生凋亡是与细胞内活性氧(ROS)的水平密切相关。进一步研究证明Ag-SP-DNC可破坏细胞线粒体膜电位,诱导caspase-3活化促使凋亡诱导因子AIF、EndoG从线粒体转移到细胞核诱导细胞发生凋亡。这个研究的意义在于为开发银化合物为新的抗肿瘤药物提供实验依据。方法1.常规复苏、培养人非小细胞肺癌细胞株A549细胞至对数生长期备用。2.MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法检测细胞生存率。3.SRB(磺酰罗丹明B)法检测细胞存活率。4.PI单染流式细胞术检测细胞周期情况。5. DTNB[二硫代二硝基苯甲酸]法检测细胞内GSH水平。6.倒置显微镜下观察A549细胞形态学变化。7. TRITC—鬼笔环肽标记扫描共聚焦显微镜观察细胞微丝骨架。8. Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪分析细胞凋亡率。9.JC-1标记流式细胞仪分析细胞线粒体膜电位。10.荧光探针DCFH-DA进行细胞内活性氧水平检测11.caspase-3(Asp175) antibody (Alexa fluor488conjugate)标记流式细胞术检测细胞内caspase-3活化水平。12.Fluo-3/AM标记流式细胞术检测细胞内游离Ca2+水平。13. Western blot检测细胞内AIF, EndoG, Bcl-2, P53等凋亡相关蛋白表达。14.实验结果采用SPSS16.0软件进行Student’s T test, P<0.05表示有显著差异,P<0.01表示有非常显著的差异。结果1. Ag-SP-DNC明显抑制A549细胞的生长。2.与正常对照组相比,Ag-SP-DNC可将A549细胞周期抑制于G2/M期,抑制细胞分裂增殖。3.10μmol·L-1的Ag-SP-DNC可消耗细胞内GSH,使细胞内GSH水平降低,能够明显抑制A549细胞存活。4.10μmol·L-1的Ag-SP-DNC对细胞形态有明显影响,细胞形态发生明显改变,胞体皱缩。5.10μmol·L-1的Ag-SP-DNC对细胞微丝骨架结构有明显影响,显著破坏细胞微丝骨架结构。6.10μmol·L-1的Ag-SP-DNC能够诱导细胞凋亡,高浓度时细胞凋亡率明显增加；若同时加入外源性的GSH,细胞凋亡率恢复至正常对照组水平。7.与正常对照组相比,10μmol·L-1的Ag-SP-DNC可显著改变细胞线粒体膜电位,细胞线粒体膜电位发生明显改变(绿光／红光比值明显增大)；若同时加入外源性GSH,细胞线粒体膜电位恢复至正常对照组水平。8.与正常对照组相比,10μmol·L-1的Ag-SP-DNC可明显改变细胞内活性氧的水平,细胞内活性氧的水平明显增加；若同时加入外源性GSH,细胞内活性氧的水平恢复至正常对照组水平。9.10μmol·L-1的Ag-SP-DNC可明显增加细胞内caspase-3活性水平。10.10μmol·L-1的Ag-SP-DNC可明显增加细胞内游离Ca2+浓度水平。11.10μmol·L-1的Ag-SP-DNC可明显增加细胞内AIF, EndoG, P53蛋白表达,减少Bcl-2蛋白表达。结论Ag-SP-DNC可诱导A549细胞发生凋亡,其机制为活性氧调控的线粒体依赖性细胞凋亡通路。Ag-SP-DNC可消耗细胞内GSH,使细胞内ROS水平升高,降低Bcl-2蛋白表达,同时升高P53蛋白表达,即活性氧水平增高、抗凋亡和诱导凋亡的蛋白表达不均衡导致细胞内线粒体膜电位产生破坏和钙超载。继而激活caspase-3,并且AIF和EndoG从线粒体转运到细胞核。在A549细胞中Ag-SP-DNC通过caspase依赖性和caspase非依赖性双重作用诱导细胞产生凋亡。