【目的】深入了解广州地区呼吸道合胞病毒(RSV)及肺炎支原体(MP),四种不同亚型人冠状病毒的流行病学情况及临床特征,提高临床诊断的确诊率,并尝试对鼠源单克隆杂交瘤细胞株3D7的抗HAdv-3中和抗体基因进行人源化改造,为治疗性抗体的研发奠定基础。【方法】一、采集2012年1月~2014年1月期间在广州地区急性呼吸道疾病患儿(≤14岁)咽拭子标本,提取标本核酸,利用荧光定量PCR进行RSV与MP检测;并对其流行特征进行分析。二、采集2009年7月1日~2016年6月30日广州医科大学附属第一医院及中山大学孙逸仙纪念医院患有急性呼吸道感染的儿科住院患儿的咽拭子标本,共11399例。采用了荧光定量PCR方法对上述标本进行4种人类冠状病毒(Coronavirus,HCoV)检测,包括HCoV-229E,HCoV-NL63,HCoV-OC43和HCoV-HKU1,随后取出人冠状病毒阳性标本进行11种常见呼吸道病毒检测。并对其流行特征进行分析。三、利用TRIzoL裂解分泌抗HAdv-3鼠源性单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株3D7提取全RNA,并通过逆转录为cDNA。利用多条特异性简并引物通过PCR扩增鼠源性mAb轻链和重链可变区基因。把鼠源性mAb轻链可变区基因及重链可变区基因分别克隆至Pa-L5(含人轻链信号肽及人轻链恒定区基因)构建L链,克隆至Pa-H2(含有人重链信号肽及人重链恒定区基因)构建H链,然后把L链通过基因扩增酶切克隆至Pc-DNA3.1(+)中,构建pcDNA3.1-3D7L载体,把H链通过基因扩增酶切克隆至Pc-DNA3.1(+)中,构建pcDNA3.1-3D7H载体。把pcDNA3.1-3D7L与pcDNA3.1-3D7H质粒以1:1比例共同转染CHO-S细胞进行表达及构建稳定细胞系。【结果】一、在3760例患儿中,检出RSV 392例,阳性率为10.4%;检出MP 339例,阳性率9.0%。在RSV阳性病例中,年龄在0~9个月患儿最高,达19.6%(181/923例)。RSV流行高峰发生于2012年2月~4月和2013年1月~4月,阳性率分别为26.8%(136/507例)和18.0%(151/839例)。在MP阳性病例中,年龄在6~10岁阳性率最高,达20.1%(97/484例),MP流行高峰发生在2012年7月~10月和2013年6月~10月,阳性率分别为16.3%(92/564例)和13.4%(124/922例)。在上呼吸道症状中,RSV感染患儿鼻塞[28.6%(112/392例)]、流涕[33.2%(130/392例)]发生率显著高于MP阳性患儿[15.0%(51/339例)、20.6%(70/339例)],2组比较差异均有统计学意义(P均<0.001);RSV感染患儿咳嗽[78.1%(306/392例)]、咳痰[20.4%(80/392例)]发生率显著低于MP阳性患儿[90.0%(305/339例)、27.1%(92/339例)],2组比较差异均有统计学意义(P<0.001,P=0.032)。在下呼吸道症状中,RSV阳性患儿气喘[33.2%(130/392例)]、气促[13.5%(53/392例)]、喘鸣音[29.3%(115/392例)]、痰鸣音[18.9%(74/392例)]发生率显著高于MP阳性患儿[11.5%(39/339例)、6.5%(22/339例)、11.5%(39/339例)、10.6%(36/339例)],2组比较差异均有统计学意义(P<0.001,P=0.002,P<0.001,P=0.002)。MP阳性患儿双肺呼吸音粗[59.2%(201/339例)]较RSV阳性患儿[40.1%(157/392例)]更为多见,2组比较差异有统计学意义(P<0.001)。二、总HCo V阳性率为4.3%(489/11399),OC43阳性率为3.0%(346/11399),229E阳性率为0.6%(65/11399),NL63阳性率为0.5%(60/11399),HKU1阳性率为0.3%(38/11399),其中一些患儿存在共感染多型HCoV的情况。总HCoV阳性率在所有年龄组中在3.3%~5.5%之间。总HCoV和OC43在7~12个月的年龄段的患儿比例显著最高(p<0.001)。总HCoV、OC43、229E、NL63和HKU1阳性率最高的月份分别出现在2012年四月(15.3%,25/163)、2012年四月(14.1%,23/163)、2011年二月(10.4%,8/77)、2009年九月(7.7%,3/39)和2010年六月(6.2%,5/81)。而在临床症状上分析,只感染一种HCoV的患儿症状与共感染其他HCoV分型及其他常见的呼吸道病毒患儿症状作对比,只感染一种HCoV的患儿高热(≥38°C)(p=0.014)和不正常肺呼吸(p=0.043)症状明显比共感染其他HCoV分型及其他常见的呼吸道病毒的患儿多。另外,在HCoV 4种分型的患儿症状对比,咳嗽(p=0.032),肺炎(p=0.026),不正常肺呼吸(p=0.002)症状呈显著差异。在HCoV阳性患儿共感染病例中,出现最普遍的呼吸道病毒是流感病毒A型(21.6%,50/231)和呼吸道合胞病毒(21.6%,50/231)。三、经过3轮单克隆筛选,CLEIA结果显示抗体表达水平达到20mg/L,通过western blotting检测到有完整的抗体分子表达并且抗体结构正确,经体外微量中和实验检测该抗体有中和活性。【结论】一、广州地区RSV的主要感染人群是0~9个月的儿童,重点在每年1月~4月;MP的主要感染人群是6~10岁的儿童,重点在每年6月~10月。预防工作要全年进行,预防因RSV和MP感染导致的住院率增高。二、广州地区总HCo V主要感染人群是7~12个月的年龄段的儿童,重点防控时间在春季及秋季。其中,OC43主要感染人群是7~12个月的年龄段的儿童,重点防控时间在春季及秋季,229E主要感染人群是4~6个月的年龄段的儿童,重点防控时间在春季,NL63主要感染人群是7~12个月的年龄段的儿童,重点防控时间在秋季,而HKU1重点防控时间在夏季。三、本研究成功构建了抗HAdv-3鼠/人嵌合中和抗体真核表达质粒,并在CHO-S细胞中稳定表达,表达的抗体也被证实有中和活性。