【摘 要】
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目的:慢性心理应激被认为是血管老化和心血管疾病(CVD)的危险因素,但慢性应激相关的血管老化机制尚不清楚。DPP-4在人类病理生理学中作用多样,在心血管疾病的发生和发展过程中起着关键作用,但DPP-4在应激相关的血管老化中的作用知之甚少。故本实验研究DPP-4在应激性小鼠血管老化中的相关作用,着重探讨氧化应激和炎症反应在应激性小鼠血管老化中的作用机制,为今后在临床上对应激相关血管老化性疾病的防治提
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目的:慢性心理应激被认为是血管老化和心血管疾病(CVD)的危险因素,但慢性应激相关的血管老化机制尚不清楚。DPP-4在人类病理生理学中作用多样,在心血管疾病的发生和发展过程中起着关键作用,但DPP-4在应激相关的血管老化中的作用知之甚少。故本实验研究DPP-4在应激性小鼠血管老化中的相关作用,着重探讨氧化应激和炎症反应在应激性小鼠血管老化中的作用机制,为今后在临床上对应激相关血管老化性疾病的防治提供新的思路。方法:1.观察慢性应激对血管老化的影响,将8周龄雄性小鼠随机分为非应激组(Non-stress组)和应激组(Stress组)。两组均给予蒸馏水灌胃(0.2ml/次,2次/天),Stress组小鼠给予固定应激14天(4小时/次/天)。14天后采集两组小鼠血液、主动脉、腹股沟和皮下脂肪组织进行以下检测:①腹股沟、皮下脂肪称重;(②β-Gal 染色观察小鼠主动脉衰老情况;③ 化学发光法测定血浆中 DPP-4 浓度;④RT-PCR 对 gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox、ICAN-1、VCAN-1、MCP-1、MMP-2、MMP-9、CatS、CatK、eNOS等目标基因进行定量分析;⑤免疫蛋白印迹法测定eNOS、SirT1、p-AktSer473、gp91phox、p53、p27、p22phox、p21、p16INK4A的蛋白表达。2.观察DPP-4抑制剂对慢性应激性血管老化的影响,将8周龄雄性小鼠随机分为应激组(Stress组)和应激+阿拉格列汀组(S-Ana组),两组均给予固定应激14天(4小时/次/天),同时S-Ana组给予DPP-4抑制剂阿拉格列汀30mg/kg/次灌胃(2次/天),Stress组给予蒸馏水0.2ml/次灌胃(2次/天),持续14天。检测方法同1。3.培养HUVECs,利用H2O2诱导HUVECs的氧化应激模型,实验分为3组,实验结束后提取细胞RNA和蛋白。进行以下检测:①RT-PCR技术检测gp91phox、p22phox、ICAN-1、VCAN-1、MCP-1、MMP-2、MMP-9、CatS、CatK、eNOS等目标基因表达水平;②免疫蛋白印迹法测定eNOS、p-AktSer473、p21、p16INK4A的蛋白表达。结果:1.慢性应激降低腹股沟、皮下脂肪重量,加速主动脉老化,增加血浆DPP-4水平。gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox、ICAN-1、VCAN-1、MCP-1、MMP-2、MMP-9、CatS、CatK基因水平在应激小鼠主动脉中升高,eNOS基因水平降低。应激增加 p-AktSer473、gp91phox、p53、p27、p22phox、p21、p16INK4A 的蛋白表达,降低 eNOS和SirT1的水平。2.DPP-4抑制剂使应激小鼠皮下脂肪重量增加,血浆DPP-4水平降低,抑制血管老化。DPP-4 抑制剂提高 eNOS 基因表达,降低 gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox、ICAN-1、VCAN-1、MCP-1、MMP-2、MMP-9、CatS、CatK 基因表达。同时,降低p-AktSer473、gp91phox、p53、p27、p22phox、p21、p16INK4A 的蛋白表达,提高 eNOS 和SIRT1的水平。3.在体外,H2O2处理显著降低HU VEC s中的eNOS基因表达,增加了 gp91 phox、p22phox、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、MMP-2、MMP-9、CatS 和 CatK 的基因水平。DPP-4抑制剂抑制H2O2诱导的eNOS基因表达下降,也能显著抑制gp91 phox、p22phox、VACM-1、ICAM-1、MCP-1、CatS和CatK基因的表达。阿拉格列汀使氧化应激条件下内皮细胞eNOS蛋白的表达增加,p16INK4A和p21蛋白的表达受到抑制。LY294002预处理降低了阿拉格列汀对HUVECs中eNOS和p-AktSer473表达的有益影响,AG490对这两种靶向分子无影响。结论:DPP-4可能是通过氧化应激的产生、血管炎症反应及蛋白水解促进慢性应激小鼠血管老化,提示DPP-4可能成为代谢性心血管疾病中慢性应激相关血管老化的一个新治疗靶点。
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