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目的：视网膜色素上皮（RPE）细胞内活性氧（ROS）的过多产生，导致细胞处于氧化应激状态，从而产生一系列的眼底疾病如年龄相关黄斑变性（AMD）。AMD是一种不可逆的致盲性眼病，目前临床上缺乏有效的治疗手段能够抑制该类疾病的发展，只能在某些渗出性AMD的晚期采取一定的干预，抑制新生血管的形成，从而延缓疾病的进一步恶化。如何在AMD疾病的早期干预病程的发展，从而有效抑制该疾病的发生，是眼科临床亟待解决的一大挑战。本论文致力于开发新型的具有优异氧还原催化活性的纳米体系，用于RPE细胞内过量ROS的消除，从而有效缓解RPE细胞的氧化应激状态，在早期干预AMD的病程，为眼科临床治疗AMD提供新的思路和策略。
方法：本论文采用本实验室自主发明的边缘功能化球磨法，率先通过含氮生物多肽如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和石墨粉共混球磨，制备得到bFGF修饰的氮掺杂石墨烯（FG）纳米体系。通过原子力显微镜和透射显微镜对所制备的FG进行微观形貌表征，确认FG的形貌与尺寸大小。采用拉曼（Raman）光谱法、傅里叶红外（FTIR）光谱法和X射线光电子能谱法（XPS）等多种技术对所制备的FG的理化性能进行了表征，以检测FG的内在分子结构。通过CCK-8细胞存活率实验考察FG的生物相容性。之后，我们在细胞层面详细考察了所制备的FG对于光损伤RPE细胞模型内过量的ROS的消除能力。首先通过蓝光照射（6000Lux蓝光照射3h）ARPE-19细胞构建光损伤RPE细胞模型。随后采用（Dihydroethidium，DHE）染色法确认氧化应激态光损伤细胞模型的建立，以及FG对于细胞模型内过量ROS的消除能力。然后进一步检测FG对于光损伤细胞模型内ROS攻击的靶点物质的变化情况，包括脂质过氧化物（如丙二醛，MDA）的产生、胞内蛋白酶如乳酸脱氢酶（LDH）的外释，以及彗星实验检测DNA的损伤情况。通过流式细胞仪、细胞存活率（CCK-8）法、活死细胞双染等多种方法，检测细胞凋亡情况的变化。在此之后，我们进一步在分子层面，探讨了FG消除RPE细胞内ROS的作用机制，为FG潜在的应用提供理论基础。通过Western Blot法考察FG对细胞内多条氧化应激相关的通路信号的影响，包括氧化应激中保护性蛋白如热休克蛋白家族（如Hsp27，Hsp70和Hsp90）等表达量的变化情况，以及氧化应激中的破坏蛋白如p66Shc和p53等的表达量的变化。然后进一步通过JC-1染色法和流式细胞仪分析了线粒体膜电位的变化。最后，本论文在动物层面，考察了FG在眼内应用的可行性。通过蓝光照射C57BL/6小鼠（1.0×105Lux，4h），构建光损伤小鼠动物模型。采用视网膜冰冻切片和DHE染色法考察FG对于小鼠模型眼内过量ROS的消除能力。然后通过眼底彩照法、眼部光学相干断层成像（OCT）法、视网膜电图（ERG）法等多种眼科临床检测手段，考察FG对于动物模型眼部结构和视觉功能的影响。
结果：FG的微观形貌表征结果表明，所制备的FG为典型的石墨烯纳米片结构，其厚度约为1.4nm。水分散性实验说明了FG具有良好的亲水性，能够在水相稳定分散2周以上。一系列的理化性能表征结果证实了FG是由bFGF通过其分子中的氮原子掺杂π-π共轭的石墨烯碳环所得到的，并且氮掺杂类型主要为具有良好氧还原催化活性的吡咯型氮。细胞毒性实验发现高达10μg/mL的FG诱导的细胞生存率在90%以上，表明其良好的生物相容性。DHE检测结果发现了FG对于RPE细胞模型内过量的ROS具有优异的消除能力，在FG浓度为100ng/mL时，能够使得光损伤引起的ROS的量下降70%以上。进一步的检测发现，FG能够很好的保护细胞模型内容易被ROS攻击的靶点物质，包括使得MDA量降低64%，LDH的释放量减少60%，DNA损伤降低60%以上。细胞实验进一步证实了FG能够使得细胞模型中由于氧化应激引起的细胞凋亡率降低了70%，表明了FG能够很好的缓解细胞的氧化应激损伤，保护细胞。此外，在分子机理研究结果中发现，FG会参与细胞内多条氧化应激相关的通路，包括上调氧化应激中保护性蛋白如热休克蛋白家族（Hsp27，Hsp70和Hsp90）的表达量，提高细胞对氧化应激的抵抗能力。与此同时，FG也会下调氧化应激中的破坏性蛋白，如p66Shc和p53的表达量，减缓氧化应激引起的细胞凋亡。之后，FG通过多途径作用于线粒体上，有助于维持线粒体膜电位，阻止线粒体内容物的释放，从而有效阻止线粒体依赖的细胞凋亡通路的开启。最后，本论文通过动物实验，进一步证实了FG优异的ROS消除性能和其在眼科应用的可行性。光损伤小鼠模型中视网膜的冰冻切片和DHE组织染色实验结果，发现了FG能够有效降低视网膜，尤其是与FG直接接触的RPE层内过量的ROS。眼底彩照、OCT和ERG等多种检测结果，进一步证明了FG纳米体系不会对小鼠眼部正常的生物结构和视觉功能造成损伤，预示FG具有很好的眼科应用前景。
结论：本论文通过共混球磨bFGF和石墨粉制备了具有良好ROS消除活性、亲水性和生物相容性的新型氮掺杂石墨烯纳米体系FG。通过细胞实验和动物实验，系统证实了FG对于光损伤模型中过量ROS的良好的消除能力，及其在眼科临床应用的可行性。进一步通过分子机理研究，阐明了FG对于细胞氧化应激状态的缓解及其抑制的作用机理。本论文的研究结果，有望为眼科临床上治疗AMD疾病提供全新的策略，并为氧化应激相关的其他眼底疾病及系统性的慢性疾病如阿兹海默症、帕金森氏症、动脉粥样硬化、甚至癌症等的治疗提供了新的思路和方向。
方法：本论文采用本实验室自主发明的边缘功能化球磨法，率先通过含氮生物多肽如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和石墨粉共混球磨，制备得到bFGF修饰的氮掺杂石墨烯（FG）纳米体系。通过原子力显微镜和透射显微镜对所制备的FG进行微观形貌表征，确认FG的形貌与尺寸大小。采用拉曼（Raman）光谱法、傅里叶红外（FTIR）光谱法和X射线光电子能谱法（XPS）等多种技术对所制备的FG的理化性能进行了表征，以检测FG的内在分子结构。通过CCK-8细胞存活率实验考察FG的生物相容性。之后，我们在细胞层面详细考察了所制备的FG对于光损伤RPE细胞模型内过量的ROS的消除能力。首先通过蓝光照射（6000Lux蓝光照射3h）ARPE-19细胞构建光损伤RPE细胞模型。随后采用（Dihydroethidium，DHE）染色法确认氧化应激态光损伤细胞模型的建立，以及FG对于细胞模型内过量ROS的消除能力。然后进一步检测FG对于光损伤细胞模型内ROS攻击的靶点物质的变化情况，包括脂质过氧化物（如丙二醛，MDA）的产生、胞内蛋白酶如乳酸脱氢酶（LDH）的外释，以及彗星实验检测DNA的损伤情况。通过流式细胞仪、细胞存活率（CCK-8）法、活死细胞双染等多种方法，检测细胞凋亡情况的变化。在此之后，我们进一步在分子层面，探讨了FG消除RPE细胞内ROS的作用机制，为FG潜在的应用提供理论基础。通过Western Blot法考察FG对细胞内多条氧化应激相关的通路信号的影响，包括氧化应激中保护性蛋白如热休克蛋白家族（如Hsp27，Hsp70和Hsp90）等表达量的变化情况，以及氧化应激中的破坏蛋白如p66Shc和p53等的表达量的变化。然后进一步通过JC-1染色法和流式细胞仪分析了线粒体膜电位的变化。最后，本论文在动物层面，考察了FG在眼内应用的可行性。通过蓝光照射C57BL/6小鼠（1.0×105Lux，4h），构建光损伤小鼠动物模型。采用视网膜冰冻切片和DHE染色法考察FG对于小鼠模型眼内过量ROS的消除能力。然后通过眼底彩照法、眼部光学相干断层成像（OCT）法、视网膜电图（ERG）法等多种眼科临床检测手段，考察FG对于动物模型眼部结构和视觉功能的影响。
结果：FG的微观形貌表征结果表明，所制备的FG为典型的石墨烯纳米片结构，其厚度约为1.4nm。水分散性实验说明了FG具有良好的亲水性，能够在水相稳定分散2周以上。一系列的理化性能表征结果证实了FG是由bFGF通过其分子中的氮原子掺杂π-π共轭的石墨烯碳环所得到的，并且氮掺杂类型主要为具有良好氧还原催化活性的吡咯型氮。细胞毒性实验发现高达10μg/mL的FG诱导的细胞生存率在90%以上，表明其良好的生物相容性。DHE检测结果发现了FG对于RPE细胞模型内过量的ROS具有优异的消除能力，在FG浓度为100ng/mL时，能够使得光损伤引起的ROS的量下降70%以上。进一步的检测发现，FG能够很好的保护细胞模型内容易被ROS攻击的靶点物质，包括使得MDA量降低64%，LDH的释放量减少60%，DNA损伤降低60%以上。细胞实验进一步证实了FG能够使得细胞模型中由于氧化应激引起的细胞凋亡率降低了70%，表明了FG能够很好的缓解细胞的氧化应激损伤，保护细胞。此外，在分子机理研究结果中发现，FG会参与细胞内多条氧化应激相关的通路，包括上调氧化应激中保护性蛋白如热休克蛋白家族（Hsp27，Hsp70和Hsp90）的表达量，提高细胞对氧化应激的抵抗能力。与此同时，FG也会下调氧化应激中的破坏性蛋白，如p66Shc和p53的表达量，减缓氧化应激引起的细胞凋亡。之后，FG通过多途径作用于线粒体上，有助于维持线粒体膜电位，阻止线粒体内容物的释放，从而有效阻止线粒体依赖的细胞凋亡通路的开启。最后，本论文通过动物实验，进一步证实了FG优异的ROS消除性能和其在眼科应用的可行性。光损伤小鼠模型中视网膜的冰冻切片和DHE组织染色实验结果，发现了FG能够有效降低视网膜，尤其是与FG直接接触的RPE层内过量的ROS。眼底彩照、OCT和ERG等多种检测结果，进一步证明了FG纳米体系不会对小鼠眼部正常的生物结构和视觉功能造成损伤，预示FG具有很好的眼科应用前景。
结论：本论文通过共混球磨bFGF和石墨粉制备了具有良好ROS消除活性、亲水性和生物相容性的新型氮掺杂石墨烯纳米体系FG。通过细胞实验和动物实验，系统证实了FG对于光损伤模型中过量ROS的良好的消除能力，及其在眼科临床应用的可行性。进一步通过分子机理研究，阐明了FG对于细胞氧化应激状态的缓解及其抑制的作用机理。本论文的研究结果，有望为眼科临床上治疗AMD疾病提供全新的策略，并为氧化应激相关的其他眼底疾病及系统性的慢性疾病如阿兹海默症、帕金森氏症、动脉粥样硬化、甚至癌症等的治疗提供了新的思路和方向。