FT基因是开花信号通路的促进因子,是花发育通路的汇集点,整合来自光周期、春化和自主等不同花发育通路的信号,在高等植物花发育中发挥着重要作用。FT基因不仅调节营养生长向生殖生长的转变,还控制着植物的生长节奏、生长与休眠之间的转换。桑树从播种到开花需要3-5年时间,这一漫长幼年期是遗传育种研究的最大障碍,同时也是影响早期桑果产量的主要因素。桑树成花素FT(MaFT)家族基因的表达和功能调控模式,至今没有研究报道。论文围绕MaFT基因在瞬时表达和嫁接桑树中及转化进拟南芥和苜蓿内的功能展开研究。本研究主要结果如下:1.构建pET28a-FT原核表达载体表达FT蛋白,蛋白以包涵体形式存在;利用His标签纯化蛋白,纯化后蛋白通过尿素梯度法,经透析膜进行复性,复性蛋白与弗氏佐剂、弗氏不完全佐剂融合后免疫新西兰家兔,4次免疫后,获得1:512,000高效价抗体。2.构建植物pBE2113-FT-GFP双元表达载体,转化入GV3101,LBA4404农杆菌菌株内。蘸花法转染野生型拟南芥,通过卡那霉素抗性、RT-PCR、免疫蛋白印迹筛选出阳性植株,得到转基因拟南芥。结果发现,转基因拟南芥比野生型拟南芥提早10d左右出现早花现象,且叶片数平均只有5片,而野生型拟南芥平均生长出15个叶片时才开花。试验结果表明,MaFT基因能够促进拟南芥提早开花。3.将携带GUS的pBE2113质粒转化进农杆菌GV3101,LBA4404菌株内,通过优化农杆菌介导的瞬时表达体系,发现在桑叶内,GV3101农杆菌菌株更适合进行瞬时表达;选用OD600分别0.5、1.0、1.7三个菌体浓度进行瞬时表达,发现农杆菌菌体浓度对表达效率影响不大,最终选OD600为0.5作为瞬时表达的菌体浓度;比较不同基因型植株和叶片位置对瞬时表达的影响,结果表明:肉质厚实的新鲜叶片比老叶片更利于瞬时表达效率的提高;组培苗和实生苗影响不大,选用幼龄期的实生苗作为表达对象。在桑树叶片内瞬时表达携带pBE2113-FT-GFP质粒的农杆菌菌株GV3101,倒置荧光显微镜观察显示,在桑树叶片、叶柄,叶茎和顶芽内都发现有绿色荧光;实时定量PCR分析表明,瞬时表达后第4天叶片内FT基因表达量最高,后逐渐下降;蛋白免疫印迹试验表明FT蛋白可以通过筛管从叶片传导到顶芽内。4.为检测桑树FT基因的表达和FT蛋白的传导规律,将1年生实生桑的枝条嫁接于20年生的植株上,实时定量PCR分析嫁接实生桑与同龄未嫁接实生桑叶片和顶芽内的FT在mRNA水平上的变化。结果表明,在同龄未嫁接实生桑叶片内FT相对表达量低,而嫁接三个月后实生桑成熟叶片内的FT相对表达量升高;嫁接一年后实生桑叶片内FT的相对表达量是嫁接当年的2倍,是同龄未嫁接实生桑相对表达量的3倍;两年内未嫁接实生桑叶片内FT表达增加不明显;免疫蛋白印迹试验表明,嫁接一年后,在嫁接实生桑顶芽内未检测到FT蛋白,只在叶片内检测到FT蛋白。综合qRT-PCR与Western blot结果分析,通过嫁接,成年桑树内的FT蛋白传导进嫁接的实生桑内,导致FT蛋白含量升高,表明桑树FT蛋白主要在叶片内表达,FT蛋白可以从供体桑树传导到受体桑树。5.优化农杆菌侵染法转化苜蓿进行稳定表达的条件,得到在共培养时间3天,农杆菌的浓度0.6,Kan的最适筛选压为50 mg/L,Carb最适浓度为500 mg/L时,苜蓿的转化率最高。将桑树FT基因转化进苜蓿内,获得了抗性胚性愈伤组织。对诱导产生的抗性胚状体进行了针对FT和GFP基因的PCR检测,筛选出阳性胚状体,证明FT及GFP基因已整合到了苜蓿基因组中。本研究对于认识桑树开花调控分子机理、促进桑果早期丰产;调控开花基因表达;缩短童期,提早开花;提高育种效率具有重要理论意义和应用价值。由于开花时一个复杂的过程,受自身和外界环境及很多途径的调控以及桑树转基因技术方法的限制。我们的研究还处于起步状态,关于MaFT基因调控桑树成花,休眠等方面的机制还有待于更深一步的研究。